沙田柚熱激蛋白HSP90基因的鑒定分析

郭丹妮，劉玉潔，韓 愈，覃信梅，李惠敏，秦新民

（廣西師范大學生命科學學院，珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室，廣西桂林541004）

沙田柚熱激蛋白HSP90基因的鑒定分析

郭丹妮，劉玉潔，韓 愈，覃信梅，李惠敏，秦新民＊

（廣西師范大學生命科學學院，珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室，廣西桂林541004）

為探明沙田柚自交不親和分子機理，以沙田柚（Citrus grandis var.Shatianyu Hort）自交和異交花柱為材料，對其進行轉錄組測序；通過差異分析獲得相關基因，并研究其理化性質。結果表明：獲得的Hsp90基因全長2 602bp（GenBank登錄號：KU517851），開放閱讀框（ORF）全長為2 100bp，編碼699個氨基酸，編碼的蛋白質分子量為80.55KDa，理論等電點為5.01，含有1個與HSP90超家族（HSP90superfamily）相同的保守結構域。沙田柚Hsp90蛋白氨基酸的同源性與甜橙（XM＿006490568）、克萊門柚（XM＿006421973）親緣關系較近，同源性高達99%，屬同一進化分支。

沙田柚；Hsp90基因；理化性質

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）在生物細胞熱應激反應中有重要作用，廣泛存在于動物、植物細胞以及真菌中，在高溫脅迫環境下，熱激蛋白合成顯著增加［1］。根據分子量大小Hsps可分為Hsp60、Hsp70、Hsp80、Hsp90、Hsp110及smHsp（小分子量Hsp）6個家族［2］。其中，HSP90家族蛋白高度保守，參與組裝、成熟、穩定及激活各種關鍵的信號蛋白，如激素受體、蛋白激酶和轉錄因子等［3］。Hs90包括3個結構域：N端結構域（ND）、中間結構域（MD）和C端二聚體功能結構域（CD）［4］。Hsp90參與細胞骨架動力學、細胞形態以及機動性的調控。Hsp90通過一種依賴ATP的機制調控肌動蛋白和肌球蛋白的相互作用。無細胞系統的試驗證明，利用ATP能使Hsp90從F－肌動蛋白上解離，細胞中Hsp90表達水平升高使細胞形態發生改變和增加細胞遷移能力。

自交不親和在雌雄同株植物中比較常見，是顯花植物防止自交授粉最有效的遺傳機制［5］。許多研究結果表明，植物配子體自交不親和的關鍵因子為S基因。但近年研究發現，一些脅迫誘導基因、轉錄因子、鈣離子和激素信號相關的基因也可能參與了植物的自交不親和反應。如在罌粟屬的自交不親和（self－incompatibility，SI）反應中，胞質中游離的鈣離子濃度增加，為適應這種變化，肌動蛋白發生重排導致肌動蛋白大量解聚，從而使花粉管尖端生長受到抑制。雌蕊對花粉進行識別的信號分子是由S位點連鎖基因編碼的糖蛋白，兩者相互識別的過程實際是雌蕊信號分子與花粉信號分子識別及信號傳遞過程［6］。目前已發現，肌動蛋白細胞骨架是SI信號的靶位點［7］，在觸發SI反應后4～12h發生細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）的典型特征，即核DNA發生斷裂。Thomas等［8］研究罌粟屬SI過程發現，肌動蛋白的解聚啟動了下游PCD信號的傳遞過程。Poulter等［9］也證明，在SI誘導的PCD上游需要微絲和微管的信號整合。因此，罌粟花粉SI反應觸發PCD，從而使花粉管發生不可逆性的停止生長［10］。

此外，在體外環境中，日本梨S－RNase誘導線粒體發生改變，如膜電位崩潰、細胞色素C滲漏和膜膨脹，破壞頂端極性生長必須的tip－localized活性氧種類（reactive oxygen species，ROS），肌動蛋白細胞骨架發生解聚，降解不親和花粉管的核DNA。說明，PCD特異性發生在不親和花粉管中［1113］。Poulter等［14］通過對罌粟屬自交不親和誘發的細胞骨架蛋白質變化進行研究發現，在SI樣品與親和樣品中，熱激蛋白和分子伴侶在SI中表達量更高，有5個熱激蛋白／分子伴侶蛋白在SI樣品中特異性表達，說明這些熱激蛋白可能在自交不親和中發揮作用，已證實這些蛋白屬于熱激蛋白Hsp90家族成員［15］。

沙田柚屬于配子體高度自交不親和的蕓香科柑橘屬果樹。目前，已知沙田柚屬于配子體自交不親和，花柱1／2左右為花粉管生長抑制部位［16］，花柱和花粉管中自交不親和特異蛋白得到分離和鑒定［1718］。為了進一步探討沙田柚自交不親和的機理，筆者對自交和異交花柱進行轉錄組測序，對沙田柚熱激蛋白Hsp90基因序列進行功能預測，分析該基因編碼的蛋白質生物化學特征，旨在為深入研究沙田柚自交不親和分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料采自廣西省靈川縣潮田鄉大山口村10年樹齡的沙田柚樹。在果樹開花期間，對當天開花的花朵進行人工異交授粉（去除沙田柚雄蕊，以酸柚花粉授粉）和自交（沙田柚花粉授粉）授粉，分別收集自交和異交1～3d的授粉花柱以及當天未開花的花柱，切取1／2上部花柱，液氮速凍后，轉入－80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2 總RNA的提取和測序

對總RNA提取是采用改良的Trizol法［19］，檢測合格的RNA交由深圳華大基因科技服務有限公司進行建庫和測序。建庫和測序的程序和方法見參照文獻［20］的方法進行。

1.3 序列分析和同源性分析

利用生物信息學軟件DNAMan以及NCBI上ORF Finder分析序列，Conserved Domain Architecture Retrieval Tool分析該基因編碼的氨基酸；運用在線軟件（http：／／web.expasy.org／protparam／）和跨膜數據庫TMbase（http：／／ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html）分析Hsp90蛋白質的親疏水性以及是否存在跨膜結構；利用DNAMan軟件分析蛋白質疏水性。在線蛋白磷酸化位點分析軟件NetPhos 2.0Server預測該蛋白可能的磷酸化位點，運用在線分析軟件Predict Protein（http：／／www.predictprotein.org／）分析Hsp90蛋白的二級結構，在線軟件SWISS－MODEL預測Hsp90蛋白三級結構；用DNAman軟件對基于氨基酸序列Hsp90基因進行構樹。

2 結果與分析

2.1 基因的生物信息學性質

沙田柚熱激蛋白（CL6153.Contig3＿All）基因組序列全長為2 602bp（GenBank登錄號為KU517851），該序列的開放閱讀框為2 100bp，編碼699個氨基酸（圖1）。

圖1 Hsp90蛋白基因序列和預測氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of Hsp90protein gene and the deduced amino sequence

圖2 Hsp90蛋白的保守結構域Fig.2 Conserved domains of porcine Hsp90protein

2.2 功能結構域

由圖2可見，該蛋白質含有1個與Hsp90超家族（Hsp90superfamily）相同的保守結構域，同時該基因的N－端具有ATPase結合位點。

2.3 編碼蛋白質的親水性和跨膜區域

該基因編碼的蛋白質分子量為80.55KDa，等電點pI為5.01，分子式為C3565H5677N933O1130S27，不穩定系數為41.78，屬于不穩定蛋白。其中，該蛋白質攜帶的負電荷氨基酸（Asp＋Glu）總數為140，正電荷氨基酸（Arg＋Lys）總數為109。由圖3可見，該蛋白質編碼的肽鏈中疏水性最大值為3.26，最小值為－3.76，初步鑒定該蛋白質為親水蛋白。該蛋白存在2個跨膜螺旋，屬于跨膜蛋白。

圖3 沙田柚Hsp90蛋白的跨膜區預測Fig.3 Result of TMpred prediction on Hsp90protein of C.grandis var.Shatinyu

2.4 蛋白質的磷酸化

對Hsp90蛋白進行預測，該多肽鏈中分值≥0.5可能的磷酸化位點共有34個。其中絲氨酸（Ser）共有28個，分別位于肽鏈28位、57位、102位、118位、158位、166位、221位、257位、284位、303位、426位、440位、443位、444位、449位、471位、516位、541位、569位、597位、599位、600位、603位、604位、632位、651位、671位和695位。蘇氨酸（Thr）共有9個，分別位于肽鏈的79位、140位、141位、215位、216位、278位、327位、441位和448位。酪氨酸（Tyr）共有10個，分別位于肽鏈的27位、149位、179位、209位、282位、407位、465位、489位、493位和601位。

2.5 蛋白質的二級及三級結構

由圖4可知，沙田柚Hsp90蛋白中α－螺旋、β－折疊和其他結構比例分別為40.20%、13.16%和46.64%。該蛋白三級結構包括9個α－螺旋，4個β－折疊，由無規則卷曲連接。

圖4 Hsp90蛋白的三級結構Fig.4 The tertiary structure of Hsp90protein

2.6 不同物種間Hsp90蛋白的同源性

11種植物的Hsp90蛋白氨基酸序列的比對結果表明，沙田柚Hsp90與甜橙（XM＿006490568）和克萊門柚（XM＿006421973）氨基酸序列同源性達99%，與其他植物的氨基酸序列同源性在87%以上（圖5），說明植物體內HSP90的高度保守性。

圖5 基于氨基酸序列的Hsp90蛋白系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of Hsp90protein

3 結論與討論

Hsp90蛋白的N端通常具有ATP結合區域，該區域高度保守，胞質中的Hsp90在C端具有MEEVD基序［21］。將動物、植物以及真菌的Hsp90序列進行比對后，Gupta［22］提出，Hsp90家族蛋白存在5條特征序列。本研究獲得的CL6153.Contig3＿All編碼的氨基酸序列具有5個特征序列，同時在N端具有1個ATP結合區域，該區域是Hsp90發揮分子伴侶功能時起到重要作用。經氨基酸序列比對發現，CL6153.Contig3＿All與甜橙和克萊門柚等植物的Hsp90蛋白具有較高的同源性，通過構建系統進化樹發現，CL6153.Contig3＿All與同為蕓香科的甜橙和克萊門柚位于同一進化分支，并與番茄、辣椒和茄子等植物形成一個大分支。因此，CL6153.Contig3＿All為植物Hsp90基因家族成員。

Hsp90蛋白在細胞受到外界脅迫時，在短時間內大量合成。除參與脅迫反應，Hsp90家族蛋白還參與細胞形態與機動性、細胞骨架動力學，并與微管蛋白以及肌動蛋白結合。肌動蛋白細胞骨架作為自交不親和信號的靶位點，同時肌動蛋白解聚啟動細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）下游位點［8］，并且PCD程序的啟動使得花粉管生長停止和遭到不可逆的破壞［10］。總之，SI觸發不親和花粉的脅迫應答，其中牽涉到熱激蛋白及分子伴侶，說明熱激蛋白可能在自交不親和反應中發揮作用［14］。本研究通過轉錄組測序獲得的沙田柚Hsp90蛋白基因，關于其在沙田柚自交不親和中作用還有待進一步研究。

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（責任編輯：劉忠麗）

Identification and Analysis of HSP90 Gene in Citrus grandis var.Shatianyu

GUO Danni，LIU Yujie，HAN Yu，QIN Xinmei，LI Huimin，QIN Xinmin＊
（College of Life Science，Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection，Ministry of Education，Guangxi Normal University，Guilin，Guangxi 541004，China）

The self－pollinated and cross－pollinated style of C.grandis var.Shatianyu were used as test materials and based on the successful transcriptome sequencing technology，the authors identified a Hsp90 gene to explore the molecular mechanism of self－incompatibility.Results：Hsp90gene was 2602bp （GenBank accession number：KU517851）in length with an open reading frame（ORF）of 2100bp，encoding 699amino acids with deduced molecular weight of 80.55KDa，and theoretical pI value of 5.01，and contained a HSP90superfamily conserved domain.The homology analysis indicated that the Hsp90 protein shared 99%homology with that of Citrus sinensis（XM＿006490568）and Citrus clementina（XM＿006421973）.Phylogenetic analysis revealed that Hsp90gene showed closer kinship with that of C.sinensis and C.clementina，indicating that they belong to the same evolutionary branch.

Citrus grandis var.Shatinyu；Hsp90gene；physicochemical property

S666.3

A

1001－3601（2016）08－0328－0011－04

2016－02－17；2016－07－12修回

國家自然科學基金項目“沙田柚配子體自交不親和的分子機理研究”（31360477）；廣西教育廳項目“沙田柚花柱不親和機理研究”（2013YB036）

郭丹妮（1992－），女，在讀碩士，研究方向：植物分子生物學。E－mail：15108002583＠163.com

＊通訊作者：秦新民（1956－），男，教授，博士，從事植物分子生物學研究。E－mail：xmqin＠mailbox.gxnu.edu.cn