結核桿菌Ａｇ８５Ｂ基因疫苗的免疫保護效果研究

摘 要：為研究結核桿菌AJ95B基因疫苗的免疫原性和免疫保護效果，將雌性C57BL／6N小鼠32只，隨機分為4組，即結核桿菌Ag85B基因疫苗組、BCC組、pcDNA3．1(+)組和PBS組。取各免疫組小鼠脾細胞培養上清檢測細胞因子水平；同時進行CTL殺傷活性檢測；進一步用結核桿菌H37Rv國際標準強毒株靜脈注射攻擊小鼠，計數肺和脾組織中的結核桿菌菌落數，對小鼠部分肺和脾組織作病理切片，HE染色觀察組織病變程度，Z－N染色檢查抗酸桿菌，觀察該疫苗對小鼠結核桿菌感染的免疫保護效果。結果表明，結核桿菌Ag85B基因疫苗對小鼠結核桿菌感染有一定的免疫保護效果，能夠誘導較強的抗原特異性Th1型細胞免疫應答，細胞因子IFN-y和IL-1分泌增加，IL-4分泌減少，CTL特異性活性增加；使小鼠肺和脾組織中的結核桿菌菌落數較空載體組顯著減少，組織病變明顯減輕。

關鍵詞：結核桿菌；Ag85B；基因疫苗；免疫應答；免疫保護

中圖分類號：Q78；R378

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2006)02—0128-06

近年來，隨著人口流動的增加、結核桿菌多重耐藥性菌株的出現以及結核病與艾滋病的伴發感染，結核病的疫情再度增高，給全球結核病的防治提出了新的挑戰。降低結核病的患病率和死亡率，有效控制結核病，關鍵在于對結核病的有效預防。自1921年以來，卡介苗(BCG)就廣泛應用于結核病的預防，大量的研究表明BCG對兒童原發性結核病具有較好的預防效果，但對結核病主要流行和傳播形式的成人結核病，BCG的預防效果較差，因而研制和開發新型高效結核病疫苗對于結核病的有效控制具有十分重要的現實意義。本室構建了含結核桿菌Ag85B基因的真核表達質粒pcDNA3．1(+)-Ag85B能在體外成功表達相應抗原。在此基礎上，進一步研究了其在小鼠體內誘導免疫應答的能力和對小鼠結核桿菌感染的免疫保護效果，旨在為研制新型結核病基因疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 質粒、菌株和細胞

質粒pcDNA3．1(+)和宿主菌JM109均由本室常規保存；質粒pcDNA3．1(+)-Ag85B(含人結核分枝桿菌H37Rv株的Ag85B基因)由本室構建；結核桿菌H37Rv國際標準強毒株有中國藥品生物制品檢定所提供；EL4／Ag85B細胞(H-2^d)為轉染pcDNA3．1(+)－Ag85B，并穩定表達Ag85B的EL4細胞。

1．1．2 主要試劑

去內毒素的質粒提取試劑盒(EndoFreePlas－mid Giga Kit)購自QIAGEN公司，TritonX-100、AMV一步法RT-PCR擴增試劑盒購自上海生工生物工程公司，Tripure試劑(Tripure lsolationReagent)購自Roche公司，乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit)購自日本MBL公司，小鼠細胞因子IFN-y、Ⅱ-2、IL-4 ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美公司，BCG、結核菌素純化蛋白衍生物PPD購自成都生物制品研究所。

1．1．3 實驗動物

雌性C57BL／6小鼠，7～8周齡，體重：18—20g，構自中國醫學科學院實驗動物研究所。

1．2 方法

1．2．1 結核桿菌Ag85B基因疫苗的制備

按去內毒素的質粒提取試劑盒(EndoFreePlasmidGigaKit，QIAGEN公司)說明書提取和純化去內毒素的pcDNA3．1(+)-Ag85B質粒，分光光度計檢測A260進行核酸定量計算，A₂₆₀260／A₂₈₀比值檢測核酸純度$，用無菌PBS稀釋成1000mg／L。

1．2．2 結核桿菌Ag85B基因疫苗免疫小鼠

32只C57BL／6健康小鼠，隨機分為4組，即結核桿菌Ag85B基因疫苗組、BCG組、pcDNA3．1(+)組和PBS組，每組8只小鼠。在小鼠雙側股四頭肌多點注射0．25％Bupivacaine 100μL小鼠肌肉變性第5d，于相應部位多點注射結核桿菌Ag85B基因疫苗100μg，以pcDNA3．1(+)質粒為陰性對照，PBS作為空白對照，每隔3周免疫1次，共3次。卡介苗組尾部皮下注射1μ10⁶CFU卡介苗(BCG)1次，作為陽性對照。

1．2．3 免疫小鼠脾細胞分泌細胞因子的測定

第3次免疫后4周，每組處死3只小鼠，無菌條件下取出脾臟，分離脾細胞，細胞濃度5×10⁶／mL，每種3個復孔，每孔中加入PPD(終濃度為1mg／L)，5％CO₂孵箱中培養48h(IL-2測定)或72h(1L-4、IFN-y測定)后，收集脾細胞培養上清，用相應的ELISA檢測試劑盒檢測細胞因子水平。

1．2．4 乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定免疫小鼠特異性細胞毒性T細胞(CTL)活性

取新鮮制備的免疫小鼠脾細胞4×10₇接種于細胞培養瓶中，同時按1：4加入經絲裂霉素C去增殖的EL4／Ag85B靶細胞，培養1周作為效應細胞．以轉染了質粒pcDNA3．1(+)-Ag85B的EL4細胞作為靶細胞。將效應細胞加在96孔培養板中，設100×104、50×10⁴、10×10⁴／(每孔100μL)3個濃度，每種3個復孔。加1×10⁴／100μL孔的靶細胞懸液到效應細胞中，使效靶比例分別為100：1、50：1、10：1三個濃度，吹打混勻。按說明書分別設立靶細胞自發性釋放組(100μL孔靶細胞+100μL孔培養液)，靶細胞最大釋放組(100μL孔靶細胞+100μL孔1％TritonX-100溶液，置37℃，90％濕度，5％CO₂孵箱中孵育8h．250g離心10min。每孔取100μL細胞培養上清，加入96孔細胞培養板中，于每孔中加入100 μL含酶底物，室溫避光孵育30min．將細胞板于酶標儀中測490nm處吸光度。詳見LDH-Cytotoxicity Assay Kit使用說明書。

1．2．5 結核桿菌H37Rv國際標準強毒株攻擊C57BL／6免疫小鼠

每組另外5只免疫小鼠經尾靜脈注射結核桿菌H37Rv國際標準強毒株1×106菌落形成單位(CFU)，攻擊4周后，處死小鼠。無菌操作，取左肺和脾，稱重。并精確稱取部分含菌組織重量，生理鹽水沖洗6次，按1：1(W：V)的比例加入生理鹽水，用玻璃勻漿器勻漿，加入等體積4％硫酸處理20min以殺滅其他細菌，少量勻漿液涂片；將勻漿液按一定比例稀釋后，接種改良羅氏培養基(1-J培養基)，37℃孵箱中培養4—8周后，進行結核桿菌菌落計數。右肺和脾組織的剩余部分進行固定、石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡檢觀察組織病理改變，同時進行抗酸染色。

1．2．6 統計學分析

利用SPSSl0．0統計分析軟件，采用‘檢驗進行組與組之間的分析

2 結果

2．1 免疫小鼠脾細胞分泌細胞因子(IFN-y、Il-2、IL-4)的測定(表1)

2．2免疫小鼠脾細胞Ag85B基因特異性CTL活性的測定

按公式計算細胞毒性百分率，細胞毒性百分率(％)＝[實驗組A值-靶細胞自發性釋放組A值]／(靶細胞最大釋放組A值-靶細胞自發性釋放組A值)]×100％．結果顯示，效靶比為100：l、50：1、10：1時，結核桿菌Ag85B基因疫苗組的細胞毒。性百分率分別為55．3％、35．7％、9．2％，BCG組的細胞毒性百分率分別為28．9％、21．4％、9．8％，結核桿菌Ag85B基因疫苗組的細胞毒性百分率高于BCG免疫組、pcDNA3．1(+)陰性對照組和PBS空白對照組(p<0．01)，BCG組的細胞毒性百分率與空質粒pcDNA3．1(+)組和PBS對照組相比增高(p<0．05)(圖1)。

2．3 C57BL／6小鼠肺和脾組織涂片結果

尾靜脈注射結核桿菌H37Rv國際標準強毒株4周后，處死動物，肺和脾組織勻漿涂片，Z-N染色查抗酸桿菌，結果(表2)

２.4 C57BL小鼠肺和脾組織培養菌落計數

尾靜脈注靜射結核桿菌H37Rv國際標準強毒株4周后，外死動物，取左肺和部分脾組織勻漿，根據涂片結果按一定比例稀釋，接種L-J培養基，37孵育4周，進行結核桿菌菌落計數(表3)

2．5 小鼠肺和脾組織病理切片觀察組織病理改變

尾靜脈注射結核桿菌H37Rv國際標準強毒株4周后，處死動物，取右肺和部分脾組織進行固定、石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡檢觀察組織病理改變。

2．5．1 肺組織病理改變

結核桿菌Ag85B基因疫苗組肺結構部分區域破壞，肺組織內散在結核病灶，少許干酪樣壞死，液體滲出和淋巴細胞滲出較明顯，結核結節較多，類上皮細胞和Langhan細胞較多，少許纖維化。結果(圖2)。BCG組肺結構有少許破壞，結核結節，周圍有較多淋巴細胞滲出，肺泡內滲出較多，干酪樣壞死少，可見類上皮細胞和Lanshan細胞，結果(圖3)。pcDNA3．1(+)組和PBS組肺結構有較多區域破壞，有多個散在結核病灶，干酪樣壞死較多，液體滲出和淋巴細胞滲出明顯，大量結核結節形成，纖維化罕見，結果(圖4)。

2．5．2 脾組織病理改變

結核桿菌Ag85B基因疫苗組結核結節形成明顯，少許干酪樣壞死，類上皮細胞和Langhan細胞較多，少許纖維化；BCG組脾結構有少許破壞，可見結核結節形成，有少許干酪樣壞死，類上皮細胞和Langhan細胞浸潤；pcDNA3．1(+)組和PBS組結構破壞較明顯，可見殘缺紅髓、白髓，組織內散在多個結核病灶，可見干酪樣壞死，大量類上皮細胞和Langhan細胞聚集形成散在小結，纖維化罕見。

2．6 小鼠肺和脾組織病理切片進行結核桿菌計數

將小鼠肺、脾組織切片進行抗酸染色，檢測組織內結核桿菌負荷，油鏡下隨機選10個視野，進行結核桿菌計數(表4)。

3 討論

基因疫苗是疫苗研制的第3次革命，也為結核病疫苗的研制提供了新的思路。與傳統疫苗相比，基因疫苗具有制備簡便，性質穩定，免疫效果持久，可同時誘導體液免疫和細胞免疫應答等優點。本研究選擇結核桿菌Ag85B基因作為結核病疫苗的目的抗原。Ag85B是新近發現的結核桿菌主要的分泌抗原，具有強大的免疫保護作用，能誘導強烈的體液免疫應答和特異性Thl型細胞免疫應答，分泌高水平的IFN-γ，產生對感染細胞有強溶解能力的細胞毒性T細胞(CTL)，減少免疫鼠脾臟和肺中的細菌數，保護小鼠抵御毒性結核桿菌的攻擊。與BCG免疫保護水平相當，顯示該抗原有很大的開發潛力，可望成為結核病基因疫苗的候選抗原或作為亞單位疫苗的組分，用于結核病的預防。

本實驗主要研究結核桿菌Ag85B基因疫苗誘導小鼠產生的免疫效應和對小鼠結核桿菌感染的免疫保護效果。結果表明，結核桿菌Ag85B基因疫苗免疫小鼠后，可誘導出較強的特異性CTL反應，超過BCG組，也能夠誘導產生高水平的Thl型細胞因子IFN-γ、Il-2；而BCG在誘導產生高水平的IFN-T、11-2的同時，還能誘導Th2型細胞因子IL-4的產生。結核桿菌Ag85B基因疫苗和BCG均能明顯降低肺和脾組織內結核桿菌載菌量，保護免疫小鼠抵御結核桿菌H37Rv國際標準強毒株攻擊，結核桿菌Ag85B基因疫苗較BCG作用為弱。研究結果表明，結核桿菌Ag85B基因疫苗免疫小鼠后，在體內引起的特異性免疫應答以Thl型為主，但免疫原性不及BCG，誘導IFN-γ、Il-2的能力低于BCG，BCG則主要誘導混合型Th免疫應答。與國外其他有關結核桿菌基因疫苗的研究結果相似，結核桿菌Ag85B基因疫苗對結核桿菌感染具有一定的免疫保護效果，但保護作用不及BCG，因此，需采取構建多價基因疫苗等措施提高結核桿菌Ag85B基因疫苗的有效性，增加其對小鼠結核桿菌感染的免疫保護效果。