ＳＥＭＡ３Ｂ基因在鼻咽癌組織中的表達、雜合性丟失和甲基化分析

摘 要：SEMA3B基因定位于鼻咽癌高頻缺失區域3p21．3上，最近被證明具有抑瘤基因的功能。分析了鼻咽癌組織SEMA3B基因的表達、雜合性丟失(LOH)和甲基化情況。首先應用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法檢測了33例鼻咽癌組織和15例慢性鼻咽炎組織中SEMA3B基因的表達，結果顯示75．8％(25／33)鼻咽癌組織中SEMA3B基因表達缺失或下調，顯著低于慢性鼻咽炎組織中的表達(P=0．001)。進一步選取3個微衛星位點D3S1568、D3S1621和D3S4597分析了20例鼻咽癌組織中SEMA3B基因LOH的情況，結果表明3個位點的丟失率分別為10％、20％和15％，總的丟失率為45％，統計分析發現LOH與基因表達之間存在明顯相關(P=0．023)。最后，采用甲基化特異性PCR方法分析了SEMA3B基因啟動子區甲基化，結果發現在100％的鼻咽癌組織和73．3％的慢性鼻咽炎組織中檢測到SCMA3B基因啟動子區高甲基化．由此得出結論，SEMA3B基因在鼻咽癌組織中表達缺失或下調，LOH是引起其表達異常的原因之一。

關鍵詞：SEMA3B；鼻咽癌；抑瘤基因；雜合性丟失；甲基化

中圖分類號：R739．6

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2006)02-0183-06

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種高發于我國南方且惡性程度較高的腫瘤，病因學研究表明其發生發展與遺傳因素、EB病毒感染以及環境和飲食等多種因素密切相關。但是鼻咽癌致病的分子機制至今仍不十分清楚。有研究報道，在鼻咽癌中常發生染色體3p21．3雜合性丟失(10ssofheterozygosity，LOH)。進一步的功能學研究表明3p21．3上存在與鼻咽癌相關的抑瘤基因(tumorsuppressorgenes，TSGs)。SEMA3B基因(semaphorine 3B)定位于染色體3p21．3上，基因轉染實驗顯示SEMA3B基因的再表達可以抑制癌細胞的生長、誘導癌細胞凋亡和降低裸鼠成瘤能力，被認為是候選抑瘤基因。

為了揭示候選抑瘤基因SEMA3B是否與鼻咽癌發生發展相關，本研究采用RT-PCR、LOH和甲基化特異性PCR((methylation-specific PCR，MSP)分別檢測了鼻咽癌組織中SEMA3B基因的mRNA表達水平、等位基因丟失和啟動子區甲基化情況。

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材料與方法

1．1 材料

1．1．1 標本

所有用來分析的鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織標本均取自湖南省腫瘤醫院耳鼻喉科門診患者。鼻咽癌組織標本54例：男30例，女14例；平均年齡48．2歲；有頸部淋巴結轉移的患者40例；慢性鼻咽炎組織標本26例：男18例，女8例；平均年齡46．4歲。取材后一部分組織送常規病理檢查以明確診斷，另一部分組織立即放人液氮中儲存備用。同時收取了其中20例鼻咽癌患者的外周血標本用于微衛星位點LOH分析。所有患者均未經化療、放療和生物治療。

1．2．1 主要試劑及儀器設備

TRIzol試劑購自美國Gibco／BRL公司、逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司、廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒和熱啟動Taq酶購自日本TaKaRa公司、紫外分光光度計為德國Eppendoff公司產品、PCR儀為德國Biometra公司產品、VDS紫外凝膠攝像儀為美國Pharmacia公司產品。

1．2 方法

1．2．1 RNA抽提和半定量RT-PCR檢測SE—MA3B基因的表達

按TRIzol試劑(Gibco／BRL)說明書提供的操作程序抽提組織總RNA。用DNaseI(10u／IxL)去除總RNA中的痕量基因組DNA。取1～2 txL經過DNaseI處理的RNA進行逆轉錄反應，反應條件為42℃90min，99℃5min。用1μLcDNA產物進行PCR擴增：95℃變性5min；95℃30s，56℃ 30s，72℃30s，循環32次；72℃延伸10min。擴增SEMA3B基因cDNA的上、下游引物分別位于SEMA3B基因第12外顯子和第15外顯子上，引物序列為：上游引物5＇－GTCCTCTTCATFGGCACAGAC-3＇，下游引物5＇-GTCGCCATTCCTYACGTCTT-3＇，產物大小為345bp；同時擴增看家基因GAPDH作為內對照，引物序列為：上游引物5＇—CCACCCATGGCAAATFCCATGGCA-3＇，下游引物5＇-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3＇，產物大小為550bp。取PCR產物8μL在1．0％瓊脂糖凝膠(含0．5 mg／L溴乙啶)上電泳，紫外燈下觀察，VDS凝膠成像儀上照像。通過凝膠圖像分析軟件Bancan分析得出SEMA3B和GAPDH基因產物條帶吸光度，計算SEMA3B吸光度／GAPDH吸光度的相對比值，該比值表示SEMA3B基因的相對表達強度。

1．2．2 基因組DNA的抽提

根據《分子克隆》(第三版)描述的基因組DNA抽提方法加以修改來抽提鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織基因組DNA，具體步驟如下：組織在液氮中研磨成粉末狀，溶于0．5mLTris／ED-TA／SDS溶液中，60℃水浴30min；加入25μL蛋白酶K(2g／L)，37℃水浴過夜，然后通過酚／氯仿抽提，無水乙醇沉淀，最后溶解于無DNA酶的滅菌水中，－20℃保存備用。按照廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒(TaKaRa)的操作程序抽提配對外周血標本淋巴細胞基因組DNA。

1．2．3 微衛星位點雜合性丟失分析

以基因組DNA為模板通過PCR擴增SE—MA3B基因的3個微衛星位點D3S1568、D3S1621和D3S4597來分析鼻咽癌組織中SEMA3B基因LOH情況，引物序列均來自人類基因組數據庫(http：//www．gdb．org/)。PCR反應參數為：95℃變性12min；94℃15s，60℃15s，72℃30s，循環10次；89℃15s，60℃15s，72℃30s，循環25次；72℃延伸10min．5μLPCR產物變性后上樣于6％的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離、銀染、掃描后分析結果。當配對外周血淋巴細胞DNA的等位基因PCR擴增片段為雜合子時，可提供信息進行LOH分析。若腫瘤組織的一對等位基因PCR擴增片段缺少一條或其中一條的相對密度減少50％以上，認為有雜合性缺失。所有樣本重復3次。

1．2．4 基因組DNA的亞硫酸鹽修飾及甲基化特異性PCR擴增

基因組DNA的亞硫酸鹽修飾包括DNA的變性、修飾、脫鹽純化和脫磺化等過程。在30μL基因組DNA(10μg)中加入3．3μL新鮮配制的NaOH(0．3 mol／L)，混勻，37℃水浴變性15min；將新鮮配制的10mmol／L對苯二酚和3mol／L亞硫酸氫鈉的混合液333μL加入變性的DNA中，55℃避光孵育4h；修飾的基因組DNA按照廣譜型基因組DNA小量純化試劑盒(TaKaRa)操作步驟進行脫鹽純化處理；在脫鹽純化的DNA中加入5．5μL 3 mol／L的NaOH，室溫靜置5～10min，使其脫磺化基團，然后在2．5倍體積無水乙醇中－20℃過夜，沉淀，最后重新溶解于20μL無DNA酶的滅菌水中，－20℃保存備用。

MSP擴增原理：用亞硫酸鹽修飾基因組DNA后，DNA中的胞嘧啶由于甲基化狀態的不同保留為“C”(胞嘧啶被甲基化時)或改變為“T”(胞嘧啶未甲基化時)；分別設計甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物進行PCR擴增目的基因啟動子區序列，就能檢測出目的基因啟動子區CpG島甲基化情況。本研究中SEMA3B基因MSP擴增引物來自文獻報道。PCR反應體系(20μL)中依次加入10×PCR緩沖液、0．25 mmol／LdNTPs、0．2μmol／L上游和下游引物、2μL亞硫酸氫鈉修飾的DNA和0．5 unit熱啟動Taq聚合酶(TaKaRa)，反應的條件為：95℃變性10min；95℃30s，54℃30 s，72℃30 s，循環36次；72℃延伸10min。取10μLPCR產物在2．0％的瓊脂糖凝膠上電泳分離，VDS凝膠成像系統照像。根據凝膠圖像上相應條帶的有無來判定各樣品DNA中SE-MA3B基因啟動子區甲基化狀態，可分為完全甲基化、部分甲基化或非甲基化狀態等3種情況。

1．2．5 統計學分析

采用SPSS11．0軟件進行Wilcoxon秩和檢驗(Wilcoxon rank sumtest)。p<0．05認為有統計學差異。

2 結果

2．1 SEMA3B基因在鼻咽癌組織中的表達缺失或下調

通過半定量RT-PCR方法，檢測了鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中SEMA3B基因的mRNA表達水平。發現15例慢性鼻咽炎組織中全部穩定表達SEMA3B基因，但在33例鼻咽癌組織中僅有8例表達與慢性鼻咽炎組織相當的SEMA3BmRNA水平，表達缺失或下調率達75．8％(25／33)(圖1所示)。劉曉瓊等報道SEMA3B基因在76％(16／21)的鼻咽癌組織中表達下調或缺失，我們的結果與其基本一致。統計學分析顯示SE—MA3B基因在慢性鼻咽炎和鼻咽癌組織中的表達差異有統計學意義，且鼻咽癌組織中的表達明顯低于慢性鼻咽炎組織(p=0．001)(表1所示)；進一步分析SEMA3B基因在鼻咽癌組織中的mRNA表達水平和臨床特征之間的關系，結果說明鼻咽癌組織中SEMA3B基因的表達水平與患者的性別和頸部淋巴結轉移無相關性(p>0．05)(如表2所示)。

2．2 SEMA3B基因微衛星位點雜合性丟失分析

以基因組DNA為模板，通過PCR方法檢測了20例鼻咽癌組織及其配對外周血標本中D3S1568、D3S1621和D3S45973個微衛星位點的等位基因情況，發現3個位點均存在LOH，丟失率分別為10％、20％和15％，SEMA3B基因微衛星位點總的LOH頻率為45％，代表性LOH檢測結果見圖2。通過Wilcoxon秩和檢驗分析了LOH與基因表達水平之間的關系，提示SEMA3B基因的表達水平與其LOH存在相關(P<0．05)(如表3所示)，表明等位基因雜合性丟失是SEMA3B基因在鼻咽癌中表達異常的原因之一。

2．3 SEMA3B基因啟動子區CpG島甲基化分析

采用MSP方法分析了SEMA3B基因啟動子區CpG島甲基化情況，結果顯示SEMA3B基因啟動子區在鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中均存在高甲基化現象，甲基化率分別為100％(33／33)和73．3％(11／15)(圖3所示)，表明SEMA3B基因啟動子區甲基化與其在鼻咽癌組織中的表達缺失或下調無明顯因果關系，SEMA3B基因啟動子區高甲基化可能并不參與鼻咽癌的發生發展。

3 討論

SEMA3B基因編碼由17個外顯子組成的3．4kb的mRNA，其蛋白質由749個氨基酸組成，包括一個信號肽、一個高度保守的semaphorin結構域和一個免疫球蛋白樣結構域，是一類分泌型或細胞膜結合型信號素(Semaphorins)分子大家族成員之一。Semaphorins分子除了在神經發育過程中引導軸突選擇正確途徑以到達靶區并建立突觸聯系之外，還具有淋巴細胞激活、血管內皮細胞遷移、肺支氣管形態發生等作用，反映了這個家族成員功能的多樣性。

最近，研究結果顯示SEMA3B基因在大約80％的肺癌細胞系中表達下調或缺失，體外轉染SEMA3B基因可誘導肺癌細胞凋亡，致使肺癌細胞集落形成率下降90％，說明SEMA3B基因與肺癌發生密切相關，也提示SEMA3B基因對惡性細胞的生長具有較強的抑制作用。此外，Ochik等還發現SEMA3B基因啟動子區域含有p53蛋白結合位點，轉錄表達呈現出p53依賴性，提示SEMA3B基因可能參與了p53介導的抑癌通路。

我們發現SEMA3B基因在75．8％鼻咽癌組織中表達缺失或下調，明顯低于慢性鼻咽炎組織(p=0．001)，與劉曉瓊等報道的研究結果相似，提示SEMA3B基因可能在鼻咽癌的發生發展過程中起了一定作用。

為了探討SEMA3B基因在鼻咽癌中表達缺失或下調的分子機制，我們進一步從遺傳學和表遺傳學方面進行了分析。首先，檢測了用于基因表達分析的33例鼻咽癌組織中的20例標本的SEMA3B基因微衛星位點LOH情況，結果在9例鼻咽癌組織中存在SEMA3B基因等位基因丟失，而且統計學分析表明LOH與基因表達之間存在相關性(p=0．023)，說明LOH是SEMA3B基因在鼻咽癌中組織表達缺失或下調的分子機制之一。

DNA甲基化是表遺傳學改變的主要方式，也被認為是抑瘤基因功能失活的一個普遍分子機制。在41％～47％的非小細胞性肺癌、83％肝細胞癌和100％膽管癌中發現SEMA3B基因啟動子區存在高甲基化現象。在本研究中，我們發現SEMA3B基因啟動子區在100％的鼻咽癌組織和73．3％的慢性鼻咽炎組織中都存在高甲基化現象，與預期結果不一致。我們推測SEMA3B基因啟動子區高甲基化可能與炎癥、衰老或其它的生理和病理現象有關，而與鼻咽癌的發生發展可能無關。DNA高甲基化，特別是抑瘤基因DNA的局部高甲基化雖然與腫瘤的發生發展有著密切的關系，但是越來越多的研究也發現在正常或慢性炎癥上皮也存在有抑瘤基因的甲基化現象。如正常膀胱上皮、正?；蚵匝装Y結腸粘膜就存在抑瘤基因的甲基化，其甲基化程度與年齡的增長呈正相關，研究人員推測DNA甲基化至少可以分為兩種類型，即腫瘤相關型甲基化(TypeC methylation)和衰老相關型甲基化(Tvpe Amethylation)cI。此外，Dammann等也發現腫瘤相關基因的啟動子區甲基化在正常肺組織中存在，認為這可能與表遺傳學缺陷、印跡或組織特異性甲基化有關。隨著甲基化研究的不斷深入，人們可能還會發現許多與甲基化有關的病理或生理現象。

綜上所述，SEMA3B基因在鼻咽癌組織中表達下調或缺失，微衛星位點的等位基因丟失是其表達異常的分子機制之一。進一步分析SEMA3B基因在鼻咽癌組織中其它的遺傳學改變(如基因突變等)、表遺傳學改變(如組蛋白乙?；?及其功能，對確定SEMA3B基因是否與鼻咽癌發生發展相關有著重要的意義。