一種ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ設(shè)計新技術(shù)研究

摘 要：利用micmRNA數(shù)據(jù)庫，獲取3種微RNAmir-181a、mir-124和mir-1的成熟序列信息。基于siRNAdu-plex在形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA－induced silencing complex，RISC)過程中的不對稱性的特點，初步設(shè)計了針對上述3種微RNA的microRNA duplex。采用生物學(xué)軟件Oligo6．0分別評價其熱動力學(xué)特性，并通過改變反義鏈3’端個別堿基序列使其滿足熱動力學(xué)的需求，從而確定最終的設(shè)計序列。結(jié)果顯示，利用RISC形成過程的不對稱性，結(jié)合生物學(xué)軟件Oligo6．0的熱動力學(xué)分析來設(shè)計mjRNA duplex，是一種簡便可行、準(zhǔn)確有效的方法。

關(guān)鍵詞：微RNA；siRNA；生物信息學(xué)分析；熱動力學(xué)性質(zhì)

中圖分類號：0522；Q751

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007—7847(2006)02—0109-04

微RNA(microRNA，miRNA)是一類長約為22nt的非編碼小分子單鏈RNA，在動物體內(nèi)，它可以通過與對應(yīng)的靶序列發(fā)生不完全互補(bǔ)配對，從而抑制特異性的mRNA的翻譯，導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)合成減少。隨著分子克隆技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷進(jìn)步，科學(xué)工作者們已經(jīng)從不同物種中發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA，至今已經(jīng)確定的人類miRNA有222個，約占人類全基因組的1％左右，但它們卻調(diào)控了20％甚至更多的基因編碼產(chǎn)物。

大量的研究表明，微RNA可能在人類發(fā)育調(diào)控、細(xì)胞增殖和死亡、造血過程等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的作用。然而，在動物體內(nèi)，絕大多數(shù)的微RNA的具體功能仍然不清楚，這主要是由于miRNA靶基因識別存在一定的困難。在植物中，miRNA與靶序列發(fā)生近似完全互補(bǔ)，因而可以直接利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行預(yù)測。然而，在動物體內(nèi)應(yīng)用生物信息學(xué)來預(yù)測靶點就比較困難了，因為大多數(shù)miRNA與其靶基因間僅有7～8個左右的堿基互補(bǔ)，因而往往會有大量潛在的候選靶位點。但無論是對miRNA的功能進(jìn)行研究，還是對其靶基因進(jìn)行驗證，都需要人為地使所要研究的微RNA在體內(nèi)發(fā)生瞬時或者持續(xù)高表達(dá)，進(jìn)而進(jìn)行針對性研究，這種方法類似于采用RNA干擾的方法進(jìn)行靶基因的功能及相關(guān)研究。制備siRNA較為常用的方法包括，化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、長片段dsRNAs經(jīng)RNase III類降解、構(gòu)建siRNAs表達(dá)載體或者病毒載體、PCR制備的siR-NA表達(dá)框等。miRNA與siRNA盡管都屬于小分子非編碼RNA，但由于miRNA在形成過程、作用機(jī)制等方面的差異，決定了對miRNA研究的復(fù)雜性。本文重點要介紹的是一種基于siRNAduplex在形成RISC過程中的不對稱性的特點，結(jié)合生物學(xué)軟件Oligo 6．0進(jìn)行熱動力學(xué)計算的微RNA設(shè)計新技術(shù)，并針對mir－181a、mir－124、mir－1序列信息分別設(shè)計長為22nt左右的mir-NA duplex。

1 方法

1．1 在miRNA數(shù)據(jù)庫中查找對應(yīng)序列信息

為了設(shè)計特定的miRNA，首先必須獲取所要研究的miRNA的序列信息。目前國際上較為權(quán)威的數(shù)據(jù)庫有microRNAregistry(http：//micror-na.sanger．a(chǎn)c．uk/)；而國內(nèi)由清華大學(xué)生物信息學(xué)重點實驗室建立的microRNAdb數(shù)據(jù)庫，也提供了較為完整的miRNA的相關(guān)信息(http：//166．111．30．65/micrornadb/index．php)，到目前為止共收錄了732個miRNA的序列信息。利用這兩個數(shù)據(jù)庫，可以獲得microRNA的染色體定位、起止位點、前體及成熟序列信息(如長度、序列組成、二級結(jié)構(gòu)自由能)等。

1．2 基于功能siRNA的結(jié)構(gòu)特點設(shè)計miRNA

RNA干擾當(dāng)中非常關(guān)鍵的一步是形成RISC。最新研究表明，siRNAduplex的兩條鏈在摻入形成RISC過程中的機(jī)率并非均等，這體現(xiàn)了其在功能上的不對稱性。更確切地說，就是siRNA兩條鏈的5＇末端堿基配對的絕對和相對穩(wěn)定程度，將最終決定是其中的哪一條鏈參與RNAi。siRNA duplex的結(jié)構(gòu)決定了僅有其中一條鏈參與形成RISC，而另外一條鏈則被破壞。不對稱性也是miRNA的一大特點，在其形成過程中，類似siRNA duplex樣的中間產(chǎn)物中的miRNA鏈將最終參與RISC的形成，從而使得miRNA在體內(nèi)發(fā)生積聚。對于一個給定的靶基因mRNA來說，所設(shè)計的siRNAduplex應(yīng)使其反義鏈更適宜進(jìn)入RISC當(dāng)中，因而反義鏈的5＇末端的堿基配對在熱動力學(xué)上要比3＇末端更弱一些，這樣才能獲得形成RISC過程中的不對稱性(見圖1)。然而，為了獲得最佳siRNA的效率，在設(shè)計過程中應(yīng)該考慮盡量減少GC含量、避免反向重復(fù)序列，以及正義鏈的第3、10、13、19位存在堿基的偏好性。總體而言，siRNA的5＇末端主要負(fù)責(zé)靶mRNA的親和力，而3＇末端則主要促進(jìn)酶的催化作用。利用上述設(shè)計思路，我們可以假設(shè)mir-NA為siRNAduplex當(dāng)中的有功能鏈，按照上述的原則進(jìn)行設(shè)計，miRNA duplex的結(jié)構(gòu)要適宜RISC形成過程中的不對稱性。

2 結(jié)果

2．1 miRNA成熟序列查詢

利用microRNA registry和microRNAdb兩個數(shù)據(jù)庫查詢所要設(shè)計的miRNA的成熟序列信息。本研究中所要設(shè)計的3種miRNA分別是人類的mill81a、mir－1、mir－124。在數(shù)據(jù)庫中查詢其分別對應(yīng)的miRNA的ID名稱，如hsa-miR-181a等。所查得的3種miRNA的成熟序列信息，見表1。

2．2 根據(jù)RISC形成過程中的不對稱性原理分析所設(shè)計的miRNA

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中所給出的3種miRNA的成熟序列信息，我們分別對其5＇末端和3＇末端的序列進(jìn)行分析，初步設(shè)計了3種21～23nt的miRNAduplex，見表2．同時，利用Olig06．0軟件及最鄰近法(thenearestneighbormethod)來計算互補(bǔ)區(qū)的內(nèi)部穩(wěn)定性，并繪制相應(yīng)熱動力學(xué)曲線圖，見圖2．由圖可見，初步設(shè)計的人類的mir-18la、mir-124的正義鏈5＇末端的內(nèi)部穩(wěn)定性明顯低于3＇末端，也就是在RISC形成之初，雙鏈復(fù)合物從正義鏈的5＇端解鏈更容易。因此，這兩種miRNAduplex的設(shè)計滿足上述不對稱性的原理。而初步設(shè)計的mir－1的熱動力學(xué)特征提示其正義鏈的5＇端相比于其3＇端結(jié)合得更牢固。考慮此原因，我們將其反義鏈5＇端的第19號位置上的堿基C(對應(yīng)于正義鏈5＇端的第2號位置上堿基C)變?yōu)锳(C→A)，形成不完全的G-A配對，從而改變了正義鏈5＇端的解鏈的難易度。這種單個堿基的突變同樣也可以決定siRNAdulex對靶基因的抑制效率。最終的確定的miRNAduplex序列，見表2。

3 討論

目前，對于微RNA的功能研究，主要還是通過構(gòu)建相應(yīng)的miRNAs表達(dá)載體得以實現(xiàn)。Zeng等利用分子克隆技術(shù)將能夠表達(dá)miR-30的表達(dá)框克隆到pCMV質(zhì)粒中，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)的pCMV－miR-30質(zhì)粒，該質(zhì)粒可以在RNA聚合酶Ⅱ的作用下表達(dá)miR-30。而Chen等采用類似的方法構(gòu)建了依賴RNA聚合酶Ⅲ的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒，在不同細(xì)胞中表達(dá)了幾種與造血功能有相關(guān)的miRNAs(包括miR-223、mir-181、mir-142)。盡管如此，構(gòu)建某一個miRNA的表達(dá)載體并非易事，更何況microRNA家族成員已經(jīng)如此龐大，且又存在物種間的差異。因此，有必要找到一種便捷、且行之有效的方法，加快對于微RNA功能的進(jìn)一步研究。

前面提到，siRNA的制備可以有多種方法，但化學(xué)合成法一直被認(rèn)為是最可靠而便捷的方法。Elbashir等研究發(fā)現(xiàn)3＇端帶有2個突出堿基的2Int的siRNA在誘發(fā)序列特異性mRNA降解中最為有效。因此，也有不少研究者試圖采用直接合成的方法來研究微RNA的功能。盡管可以借鑒siRNA設(shè)計的一些原則，但微RNA的設(shè)計又有其自身的特點，本研究討論了一種簡單、方便的微RNA設(shè)計方法。我們利用RISC形成過程中的不對稱性與siRNA功能性之間的關(guān)系，同時在設(shè)計miRNAduplex的過程中，互補(bǔ)區(qū)的內(nèi)部穩(wěn)定性直接決定了miRNA的功能性。采用Oligo6．0軟件及最鄰近法對互補(bǔ)區(qū)的熱動力學(xué)特點進(jìn)行評價，從而對某些不合適的位點進(jìn)行調(diào)整，以獲得功能性的miRNAduplex。當(dāng)然，這種調(diào)整并非是固定了，在設(shè)計中可以靈活運(yùn)用。

對于理論上所設(shè)計的微RNA的有效性，還需要實驗來進(jìn)一步驗證。Lim等通過基因芯片技術(shù)研究了幾種化學(xué)合成的miRNA及其靶向的mRNA，也證實了化學(xué)合成方法的有效性。我們采用生物信息學(xué)的方法對上述實驗中的幾個微RNA進(jìn)行分析，結(jié)果滿足熱動力學(xué)的要求。同時，我們利用這種方法設(shè)計并合成mir-181a du-plex，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，進(jìn)而對mir—181a的功能和靶基因進(jìn)行了預(yù)測和分析，也取得了較好的結(jié)果(結(jié)果尚未發(fā)表)。由此可見，利用該方法來設(shè)計特定的miRNA，不僅是一種簡便可行、準(zhǔn)確有效的方法，而且將有助于加快miRNA的功能及相關(guān)研究。