幾種化學物質對蟾蜍蝌蚪生存及生長發育的影響

摘 要：在室內條件下，采用單因子急性和慢性毒性實驗法，分別研究了水環境中的pH、洗滌劑、除草劑、重金屬離子(Pb²⁺、Cu²⁺、Hg⁺)對黑眶蟾蜍蝌蚪的毒性效應。結果表明，這些水體污染物不但對蝌蚪的生存造成危害，還對蝌蚪的紅細胞有致畸作用；而其慢性毒害表現為蝌蚪身體畸形，膚色變淺，生長發育遲緩等．據此，可以利用黑眶蟾蜍蝌蚪對水污染進行監測。

關鍵詞：化學物質；生長發育；蝌蚪；黑眶蟾蜍

中圖分類號：Q959．7

文獻標識碼：A

文章編號：l007-7847(2006)02-0156-06

水體污染對水生生物造成極大的危害。消除或減輕污染，關鍵問題在于對環境進行有效的監測。兩棲動物具有水陸兩棲獨特的生活周期，依賴水環境而生存，所以水體的質量將會對蝌蚪的生長發育產生巨大的影響，通過觀察蝌蚪的形態行為特征，可以對水體進行質量評價。蝌蚪是兩棲動物變態前的幼體階段，因其細胞分裂旺盛，對環境的變化極為敏感，因此是監測環境的適宜指示物種。

國外學者較早利用蛙類及蝌蚪對農藥污染進行監測。美國在1989年就明確提出將兩棲動物作為環境質量監測的指示生物。國內此類研究起步較晚，直到20世紀90年代初才見報道，并且已有的研究主要是對水體中的某一重金屬及除草劑等有害物質的監測，賀維順等用國產洗衣粉進行了對蝌蚪紅細胞微核率影響的致突變研究，發現其有一定的劑量效應關系，且能誘發染色體損傷，而對水體的酸堿度的監測報道則很少。

本文報道了不同pH的水體、不同濃度的除草劑、洗滌劑以及重金屬溶液對黑眶蟾蜍蝌蚪的存活與生長發育的情況以及對紅細胞微核產生的影響，從宏觀和微觀不同層次上綜合分析污染危害程度，為環境評價，污染預報和污染物危險性提供依據，也為保護兩棲類和其它水生動物以及探尋更為有效的環境生物學監測方法提供科學依據。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

春季在華南師范大學生物試驗場捕捉成熟的雌雄黑眶蟾蜍(aufo melanostictus Schneider)，將其放于孵化池中產卵，以蝌蚪作為實驗材料。蝌蚪喂以混合性飼料(含面粉，魚粉，大豆粉，維生素等)，每日早晚各一次。

1．2 試劑儀器

0．1 mol／LH2S04，0．1 mol／LNaOH，市售高效無磷洗衣粉(汰漬，廣州寶潔公司；立白，廣州立白公司)，洗潔精(立白，廣州立白公司)，稻草隆(18％乙·芐·甲可濕性粉劑，有效成分：bensul-furonmethyl，acetochlor，metsulfuronmethyl，浙江天豐化學有限公司)，乙酸鉛，硫酸銅，硝酸汞，甲醇，Alsver液，Giemsa染液，磷酸緩沖液(pH＝6．8)，50μmol／LMgS04和Ca(N03)：溶液。

常規實驗器皿，pH計，解剖鏡，顯微鏡，數碼相機等。

1．3 方法

1．3．1 蝌蚪急性染毒實驗

觀察各水體化學物質對蝌蚪的作用，記錄各實驗組中蝌蚪開始死亡和全部死亡的時間，得出蝌蚪可存活的水體的pH值及洗衣粉、洗潔精、稻草隆、乙酸鉛、硫酸銅、硝酸汞的濃度范圍。每組放人出膜7d、大小相當的蝌蚪30—50尾，每24h換液1次，各組設對照1個。為統計準確，每實驗組和對照組平行設置3個重復實驗系列。所有實驗組濃度梯度的設置原則依據前人實驗和預實驗得到的致死濃度而定。

1．3．1．1 pH染毒實驗

用0．1 mol／L H₂S0₄和0．1 mol／L NaOH來調節含有50μmol／LMgS0₄和Ca(N0₃)₂母液水體(自來水作為溶劑)的酸堿度，設置各組pH值分別為3．0、3．5、3．8、4．0、5．0、10．0、10．5、11．0．

1．3．1．2 洗滌劑染毒實驗

把洗衣粉，洗潔精的母液(1g／L)用自來水來進行稀釋，得到洗衣粉濃度分別為55、50、45、40mg／L；洗潔精濃度分別為70、65、55、50mg／L。

1．3．1．3 除草劑染毒實驗

設置濃度為10、14、18、20 mg／L的稻草隆溶液。

1．3．1．4 重金屬離子染毒實驗

將乙酸鉛、硫酸銅、硝酸汞溶解配成1000mg／L的母液，取母液稀釋成不同的濃度組(乙酸鉛4、8、12、20、32mg／L；硫酸銅0．005、0．01、0．02、0．04、0．08 mg／L；石肖酸汞0．01、0．02、0．04、0．08、0．12 mg／L)。

1．3．2 蝌蚪慢性染毒實驗

根據急性染毒實驗得出蝌蚪可存活的水體pH值、洗滌劑、除草劑以及重金屬離子濃度范圍，按濃度梯度設置不同pH值、不同洗滌劑、除草劑以及重金屬離子濃度組別的水體，同時各設對照組1個，每實驗組放人出膜15d、大小相當的正常蝌蚪30—50尾進行為期2個月的慢性染毒實驗。觀察記錄各樣本中蝌蚪的存活及生長情況，并進行數碼攝像，每7d測量蝌蚪的體長、體重。

1．3．3 蝌蚪紅細胞檢測

將待測的蝌蚪從各實驗組中撈出(每實驗組中取3尾)，轉入自來水中修復。6h后剪斷蝌蚪尾巴，將尾部血直接均勻地涂在滴有Alsver液潔凈的載玻片上，自然晾干后用甲醇固定15min，干燥后用10％的Giem染色12-15min，后用自來水沖洗，干燥后鏡檢。觀察紅細胞的形態與細胞核的異常，并用數碼相機進行拍照，記錄細胞異常的類型及數目。

2 結果與分析

2．1 各環境污染因子對蝌蚪存活的影響

2．1．1 極端pH值的毒害作用

在急性實驗中，蝌蚪在不同pH實驗組的存活情況表現為雙向劑量反應。在實驗中可觀察到，蝌蚪的死亡先隨pH升高而下降，而后又隨著pH的升高而增加。當pH值為3．8—10．5時，各組蝌蚪96h存活率均為100％，說明在此范圍內，pH對蝌蚪96h存活率沒有明顯的影響。而pH低于3．8和高于10．5的各組蝌蚪至96h時僅少量存活(<5％)，pH 3．0實驗組中的蝌蚪至24h均全部死亡。根據酸性和堿性范圍96h的零致死濃度可知，蝌蚪生存的適應范圍是pH值為3．8～10．5，而蝌蚪對于pH的最低耐受限是pH 3．0．

2．1．2 洗滌劑的毒害作用

隨著洗衣粉、洗潔精溶液濃度的增加，蝌蚪的死亡率亦隨之增加。在洗衣粉溶液中蝌蚪的死亡率增加得較平緩，55 mg／L組72h死亡率可達70％。而在洗潔精溶液中蝌蚪的死亡率在濃度超過50mg／L時急速上升，55mg／L組16h死亡率達80％，32h即達100％。

2．1．3 除草劑的毒害作用

24h后，除了稻草隆溶液濃度為20mg／L的實驗組以外，其余各實驗組的蝌蚪均沒有死亡；48h后高濃度的實驗組中蝌蚪的死亡率開始增加，隨著時間的推移，各組的死亡率逐漸上升。168h后蝌蚪死亡率從小到大的順序為：13．3％>23．3％>46．7％>66．7％，其相對應的稻草隆溶液濃度分別為：10、14、18、20mg／L。

2．1．4 重金屬離子的毒害作用

pb²⁺、Cu²⁺、Hg⁺3種重金屬離子對黑眶蟾蜍蝌蚪的毒害作用明顯．實驗結果表明隨著pb²⁺、Cu²⁺、Hg⁺3種重金屬離子濃度的增加，黑眶蟾蜍蝌蚪的存活率也隨之下降。存活下來的蝌蚪的體長、尾長和體重并沒有明顯規律性變化，在同組蝌蚪個體則出現較大的分化。與對照組相比，3種重金屬離子各個濃度中的蝌蚪的體長、尾長和體重都要略小一點。

2．2 各環境污染因子對蝌蚪形態的影響

據觀察，慢性染毒實驗組中有形態畸變的蝌蚪，例如脊柱彎曲，身體萎縮變形，鼻孔大張，腹部膨大(圖1)，這些蝌蚪游泳時身體失衡，不能游直線，并且很快死亡。還發現蝌蚪的皮膚色素減少，致使皮膚透明，其內臟器官清晰可見，這種情況在pH值實驗組中最為嚴重(圖2)。

2．3 各環境污染因子對蝌蚪生長發育的影響

經過慢性的染毒，蝌蚪的生長發育出現了滯后的現象，特別是其變態的周期相對于對照組明顯延長。而在個體的生長方面，不同的染毒實驗組的蝌蚪體型都較對照組的蝌蚪存在不同程度的變化，主要表現在體長和體重方面。

pH實驗組結果表明，水體的pH值(3．8～10．5范圍內)與蝌蚪的體重與體長存在正相關。對照組中的水體的pH為7．8，而當水體的pH值低于或高于7．8時，蝌蚪的體型就會相應的減小或增加。

在洗滌劑實驗組中，不同濃度溶液對于蝌蚪的體型影響不是很明顯，而且隨著溶液濃度的增加，蝌蚪的體型變化沒有明顯的規律性。

在除草劑稻草隆染毒實驗組中，各濃度組中的蝌蚪的平均體長和體重隨著稻草隆的濃度的上升而逐漸增大。

重金屬離子實驗組中隨著Pb²⁺、Cu²⁺、Hg⁺3種重金屬離子濃度的增加，蝌蚪的體長、尾長和體重都要略小一點。

2．4 各環境污染因子對蝌蚪紅細胞形態的影響

pH、洗滌劑、除草劑和重金屬離子均可使細胞產生畸變。由于蝌蚪處于幼體階段，生長旺盛，細胞分裂快，而致畸因子通過皮膚進入蝌蚪體內，并通過內循環系統產生毒害作用。常見的細胞變形有長條形，細胞膜外凸和內陷。常見的核異常有微核，雙核，8字形核，核內凹，核碎裂，無絲分裂時核分裂不均等(圖4)。

需要指出的是，不同pH對蝌蚪紅細胞變異率不存在明顯的規律變化。洗滌劑和除草劑對蝌蚪紅細胞異常率的影響表現為隨濃度的線性關系。重金屬離子對蝌蚪紅細胞核異常的影響以微核和雙核為主，其中微核所占核異常細胞比例達到54．6％，雙核的比例是30．6％。

3 討論

3．1 蝌蚪的存活

pH對蝌蚪的存活呈雙向劑量反應。隨著pH的升高，蝌蚪的死亡率先降后升，與中國林蛙急性中毒實驗結果一致。但黑眶蟾蜍蝌蚪對酸的耐受能力比中國林蛙強，其對pH最低的耐受值是3．0，比中國林蛙蝌蚪低0．6。pH對蝌蚪造成的毒害作用主要是水體的腐蝕性。酸堿性溶液不僅對蝌蚪的皮膚具有腐蝕作用，而且能進一步腐蝕蝌蚪的內臟器官和骨骼，使蝌蚪急性中毒死亡。

當各種化學物質濃度達到一定值時死亡率有突然升高的趨勢，可見其有一個最高耐受濃度范圍，超過此濃度后，蝌蚪開始大量死亡。在同一濃度下，隨著實驗時間的推移，蝌蚪的存活率下降，這可能與蝌蚪生長發育有關。個體越大，新陳代謝活動就越強，體內積累化學物質的量亦大大增加，從而引起死亡率增加。在相同時間和相同濃度條件下，日齡越大，則死亡率越高。

3．2 蝌蚪的形態變化

在不同的pH值、不同濃度的洗滌劑、除草劑和重金屬離子的慢性毒害作用下，蝌蚪的形態發生了一些明顯的變化，表現為尾部彎曲，鼻孔大張，頭部和腹部膨大，皮膚透明等。這與分析研究得出的水體污染對兩棲動物形態的危害的主要特征相似。

在Pb²⁺處理組中蝌蚪畸形現象嚴重，其癥狀大多為尾部彎折。這一實驗現象與尤靜等人研究相似。畸形現象可能是由于蝌蚪尾部神經最早發育，而鉛對神經系統有很大毒害作用有關。此外，重金屬離子主要通過呼吸道、消化道和皮膚三種途徑進入動物的體內，對各種組織產生毒性。其中對神經系統和造血系統的毒害作用比較顯著，并且會影響生殖和發育。

由此提示，不同的pH值、不同濃度洗滌劑、除草劑以及重金屬離子不僅對蝌蚪，還可能對其它水生動物造成一定的危害。

3．3 蝌蚪生長發育的變化

由蝌蚪的體長與體重變化可知，隨著pH的升高，小型個體的比例逐漸減小，中型和大型個體的比例則不斷增加．造成這種現象的原因可能與蝌蚪的分泌排泄物呈酸性的性質有關。經測定，堿性水體經過1d后，pH下降的幅度較大，而酸性水體的pH則變化不大。激素作用的強弱，會影響到蝌蚪變態發育所需的時間。水體pH的變化對激素的作用存在一定減弱效應，使得蝌蚪變態發育的時間延長，而酸性溶液對激素的減弱作用則較為明顯。

關于除草劑對蝌蚪形態發育影響的研究報道較少。本實驗結果表明，經除草劑處理后，各組體長差異不大，但體重增加。在除草劑濃度較高時，蝌蚪反應敏感，活動相對頻繁，有可能增強攝食活動，蝌蚪進食多，發育就較快。因此認為除草劑可能通過進食活動間接影響生長發育。

實驗顯示，隨著Pb²⁺、Cu²⁺、Hg⁺3種重金屬離子濃度的增加，重金屬離子對蝌蚪生長的抑制作用差異性不顯著，有報道鎘對花背蟾蜍蝌蚪生長發育時提出蟾蜍蝌蚪體內可能存在鎘—鎘拮抗作用，使鎘的毒性作用減弱。Pb²⁺、Cu²⁺、Hg⁺在黑眶蟾蜍蝌蚪體內亦可能存在類似的拮抗作用，故隨染毒時間不斷延長，重金屬離子在蝌蚪體內的累積量不斷增加至出現拮抗作用，從而影響各種離子的毒性。

3．4 蝌蚪紅細胞異常

3．4．1 致畸因素

不同的水體污染因子對蝌蚪紅細胞的致畸機理不盡相同。引起蝌蚪紅細胞產生微核的物質主要是一些能抑制紡錘體活性的物質，例如游離原子團，過氧化物，氫氧化物，＝S，－SH，－SCN等。

高pH的水體中，含有較多的OH^－離子，再加上自來水中的過氧化物，細胞分裂旺盛的蝌蚪紅細胞的遺傳物質容易引起變異。

洗滌劑的主要成分都是一些表面活性劑，如烷基苯磺酸鈉、堿性蛋白質、熒光增白劑等。蝌蚪通過皮膚、鰓和消化器官吸收后就會大量積累。而表面活性劑可結合在細胞膜上，促使其它有毒有害化合物進入細胞，抑制紡錘體活性，導致細胞核異常，產生微核。對大鼠多次口服洗滌劑的研究發現，洗滌劑可使紅細胞微核率顯著上升。但微核率的高低不僅取決于誘變劑或紡錘體抑制劑活性的強弱，還取決于細胞分裂的速度。蝌蚪的微核率比魚類高，是與其紅細胞的高速分裂有關。除草劑對紅細胞致畸作用機理與洗滌劑的作用機理相似。

Pb²⁺、Cu²⁺、Hg⁺3種重金屬離子隨著濃度增加，蝌蚪紅細胞的核異常率也有一定程度的上升，說明其毒性也有所增加。這與前人研究報道結果一致。但這其中也存在離子間的拮抗作用，而拮抗作用與紅細胞微核的關系則有待進一步研究。

3．4．2 檢測時間

利用蝌蚪檢測水體污染的實驗，一般是將蝌蚪染毒6至7d后，進行6h的清水修復，再檢測其紅細胞微核，而陳建軍等提出蝌蚪的紅細胞微核產生數量隨著染毒時間的延伸而增加，在染毒的第8d，紅細胞微核數最多，所以其認為利用蝌蚪作染毒急性實驗時，將蝌蚪處理8～12d比較合適。也有人認為不同除草劑誘發紅細胞微核分別在一定濃度時有一個峰值，在高峰前后均處于低水平，而濃度與微核率之間無顯著相關，并認為這可能是劑量過高會抑制或終止細胞分裂，從而導致微核率下降。本實驗在各種污染因子的染毒中也觀察到同樣的現象，紅細胞產生異常的幾率隨著染毒因子濃度的增加而先升后降。

3．5 生物監測

目前環境監測主要以理化監測為主，而生物監測具有理化監測無可比擬的綜合性、真實性和靈敏性。通過生物對環境因子所做出的反應，顯示出環境污染對生物的影響，特別是對于低濃度的甚至痕量的污染物，指示生物亦可迅速做出反應，顯示其癥狀，從而使人們能掌握環境污染物是否有害及危害程度，為環境管理和保持物種的多樣性提供有效的信息。

兩棲動物蝌蚪的皮膚具有高滲透性，所以對水體污染特別敏感，即使在極低的濃度下，也能很快表現出受害癥狀。根據蝌蚪表現出來的受害癥狀，可以對污染進行定性和初步定量的分析。本實驗不僅對黑眶蟾蜍蝌蚪進行了急性染毒實驗，觀察其存活情況，還對其進行了為期2個月的慢性染毒觀察。從結果來看，酸或鹼、洗滌劑、除草劑、重金屬離子對蝌蚪的毒害作用，除了致死和使紅細胞產生微核外，還可以使其形態，體色發生改變，擾亂其生長發育。由此可見，黑眶蟾蜍蝌蚪對于水體污染因子具有高度敏感性。

蟾蜍在中國分布很廣，利用蟾蜍蝌蚪作為指示動物監測水環境有廣闊的實用前景。通過微核試驗，應用蟾蜍蝌蚪可快速檢測出環境的變化，對建立環境標準的生物監測指標，實現環境的生物監測有重要意義，并為環境水體污染的防治提供正確的指導。