應用小鼠整體原位雜交技術檢測ＭＤＭ２在鼠胚發育不同階段的表達

摘 要：整體原位雜交(whole-mount in situ hybridization，WMH)已經成為基因表達定位和表達分布模式研究的一種重要手段。該技術能在整體水平上精確地研究胚胎發育過程中基因表達的三維信息，而且為大規模篩選區域及組織特異性候選克隆提供了有利的技術手段。采用體外轉錄地高辛標記的RNA探針，檢測已知基因MDM2在鼠胚胎發育不同階段的表達模式。

關鍵詞：整體原位雜交：RNA探針；小鼠；MDM2

中圖分類號：Q132．7

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2006)02-0099-04

整體原位雜交作為檢測胚胎發育過程中基因表達整體效果的快速、有效手段，已在基因表達的時空順序和表達譜的建立等多方面得到了廣泛的應用。整體原位雜交技術一方面為大規模的篩選區域及組織特異性候選克隆提供了有利的技術手段。隨著鼠胚胎早期發育階段cDNA文庫的完善，該技術可大規模的分離胚胎發育中重要的調節子，從而為胚胎形成模式提供了一個重要的新的分子遺傳標志庫。另一方面為檢測某些細胞群在體內的原位轉錄本，并闡明分化過程中的分子遺傳事件提供了幫助。如，鼠胚胎干細胞(ES細胞)為多能干細胞，其分化有助于了解胚胎的正常發育過程，而整體原位雜交技術能檢測到其中某些少量的亞類細胞群在基因表達中的重要變化，而這些輕微的異質性是不能用總RNA的方法所能檢測到的。此外，兩個或多個基因在同一細胞內的共表達或兩個基因在相鄰細胞中的有序表達，為了解分子信號傳導通路提供了一個可靠的切入點。

目前，整體原位雜交在海膽、兩棲類等動物胚胎上已有初步嘗試。本研究采用體外轉錄DIG標記的RNA探針，檢測已知基因MDM2在鼠胚胎發育不同階段的表達模式。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物

小鼠胚胎來自懷孕的8～9d(E8-E9)的昆明白小鼠。

1．1．2 質粒

Pmdm2質粒DNA由法國PietteJ提供。質粒DNA含有T7和T3兩種啟動子，質粒全長為4495bp，包含1500bp Mdm2基因片段。

1．1．3 儀器設備

Orbital Mixer購自英國Denley公司；4℃低溫冰柜購自美國法瑪西亞公司；電熱恒溫水浴鍋購自中國北京長安科學儀器廠；體視顯微鏡以及照相接口購自廈門Motic公司；照相機購自上海海鷗照相機廠。

1．1．4 試劑

體外轉錄試劑盒MEGAScript^TM購自Ambion公司；地高辛標記與檢測試劑盒，BBR(BoehringerBlocking Reagent) 購自德國寶靈曼公司(BoehringerMannheim公司)；Formamide、CHAPS購自美國Sigma公司；其余試劑均為國產分析純．

1．2 方法

1．2．1 Pbmdm2質粒線性化

進行體外轉錄時要求線性化的模板DNA無核酸酶污染，因此在體外轉錄之前需對模板DNA進行酶切和純化。具體方法如下：

1)大量酶切反應

37℃水浴，酶切6～7h，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切情況，酶切完全后終止反應。

2)酶切產物純化回收

在酶切產物內加入7．5μL2g／L的蛋白酶K(終濃度為100mg／L)和7．5μL10％的SDS(終濃度為0．5％)，同時補充適量的超純水至體系到達150μL。充分混合，50℃水浴處理30min。此后，加入75μL苯酚／75μL氯仿，充分混合后，室溫放置5min，13000r／min于室溫離心5min。取上清于一新的0．1％DEPC處理過的1．5 mL離心管中，加入1／10體積的5mol／L NH40Ac(無RNase污染的)以及2倍體積無水乙醇(無RNase污染的)，－20℃放置1h，13000r／min，4℃離心15min沉淀DNA樣品。75％酒精(無RNase污染的)洗一次。13000r／min，4℃離心10min。將DNA樣品溶解于20μL0．1％DEPC處理的超純水中。經1％瓊脂糖凝膠電泳以及分光光度計測定DNA濃度，－20℃保存備用。

1．2．2 探針制備

采用轉錄試劑盒進行，具體操作如下：

首先，制備純化的無RNase污染的DNA模板，采用QIAGENPlasmidMinipurificationKit抽提質粒DNA，用相應的酶線性化模板DNA。蛋白酶K和SDS處理后，苯酚氯仿抽提純化線性化模板DNA。

體外轉錄反應體系：

37℃水浴孵育6h；加入1μL無RNase污染的DNase I，37℃水浴孵育15min；加入115μL無核酸的超純水和15μL NH₄0Ac終止液，加入等體積酚／氯仿飽和液抽提一次，11000r／min，4℃離心10min；取上清，加入等體積氯仿再抽提一次，11000r／min，4℃離心10min；取上清于一個新的0．1％DEPC處理的1．5 mL離心管，加入3倍體積的無水乙醇和5mol／LNH₄OAc，-20℃冰箱放置1h，11000r／min，4℃離心15min沉淀RNA，干燥后用無核酸酶的水溶解RNA。用1％瓊脂糖凝膠電泳以及分光光度儀測定探針濃度，－70℃保存備用。

1．2．3 小鼠胚胎的獲取、固定和脫水處理

選用6—8周的昆明白鼠雌雄合籠，次日上午檢查雌鼠是否有陰栓(plug)，將陰栓陽性雌鼠放于另一籠中喂養。在雌鼠懷孕后8-9d，經斷頸術處死孕鼠，取出小鼠胚胎，在解剖顯微鏡下去除所有滋養外胚層、體壁層等外膜結構后，將胚胎置于15mL預冷的4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)中，4℃固定2h．以PBT(含0．1％吐溫20的PBS)4℃洗3次，之后以100％甲醇洗3次，置－20℃備用。

1．2．4 小鼠胚胎預處理和探針雜交

將固定和脫水處理后的胚胎以30％過氧化氫：甲醇按1：5的比例漂白，室溫2h，甲醇漂洗3次，每次5min；然后依次通過75％、50％和25％的甲醇／PBT溶液各洗滌20min，PBT洗3次，每次20min；為使胚胎得到有效的漂洗，每5mL實驗管胚胎數目為：E8～9=7～10個、E1O=2個。胚胎漂白后，再以10mg／L蛋白酶K／PBT37℃處理，處理時間為7～10min；PBS-Tween水平搖洗2次，每次5min，將胚胎在0．1％。戊二醛／4％PFA／PBT室溫下再固定20min；在固定結束后，以PBT漂洗2-3次，每次5min(室溫)；加1mL預雜交液(含50％甲酰胺、1．3×SSC(pH4．5)、50mg／L酵母RNA、10％Tween 20、10％CHAPS、100mg／LHeparin)60℃水浴3次，每次1h；換含約1mg／LMDM2RNA探針的雜交液(成份同預雜交液)1mL；65℃雜交過夜。

1．2．5 終止雜交，抗體孵育和顯色

用預熱的雜交液65℃漂洗30min；預熱的溶液1(50％ frmamide／1XSSC／0．1％Tween 20新鮮配制)漂洗2次，每次1h；溶液1／MABT按1：1的比例(含100mmol/L maleic acid，150mmol/LNacl，0.1％ Tween20)室溫漂洗30min；MABT漂洗4次，每次30min；MABT／2％BBR室溫漂洗1h；2mL新鮮MABT／2％BBR／20％封閉用綿羊血清，室溫孵育1h；MABT／2％BBR／20％封閉用綿羊血清／抗地高辛抗體，4℃孵育過夜，E7-9的抗體滴度為1／2000，E10為1／5000。

1．2．6 終止顯色，固定照相

依次以MABT(含100 mmol／L maleic acid，150mmol／LNaCl，0．1％Tween 20)漂洗10次，前4次15 min，后4次30min，最后二次1h，堿性磷酸酶溶液(100mmol／LTrispH 9．5，50mmol／LMgCl2，100 mmol／L NaCl，0．1％Tween 20，5mmol／L左旋咪唑)漂洗3次(室溫)，每次10min；堿性磷酸酶溶液(100 mmol／LTris pH 9．5，50mmol／L MgCh，100 mmol／L NaCI，0．1％Tween20)室溫洗2次，每分鐘5次；堿性磷酸酶液中(含4．5 mL／LNBT，3．5 mL／LBCIP)避光反應，待顯色反應至滿意強度(室溫孵育30 min-3 d)，換PBT液(PBT：0．1％(v／v)Tween 20／1XPBS pH7．8)室溫洗6次，每分鐘10次；體視鏡下照相。

2 結果

有研究表明，MDM2可在7．5 d鼠胚胎內含有神經脊始祖細胞的神經褶頂部和8d鼠胚胎內含有遷徙前神經脊細胞的神經褶背部檢測到該基因表達。在此發育階段，具有多潛能的神經脊細胞開始離開后腦神經褶區域，在腮弓處克隆生長，并形成多種類型的細胞或者組織，例如感覺神經元，神經膠質，黑素細胞，骨／軟骨。本研究采用了DIG標記的MDM2 RNA片段作探針，體外轉錄標記長度為1．5 kb的反義鏈RNA，檢測MDM2在鼠早期胚胎(E8-E9)中的表達情況(圖1A、B、C)。雜交后經NBT／BCIP顯色發現，在8～9d的小鼠胚胎中，在胚胎前腦(B，C)、中腦(A)、后腦部位(A，B)以及背側脊索處均可檢測到紫紅色陽性信號(如箭頭所示)，這與所報道的表達情況一致，說明該方法用于檢測MDM2的表達分布是可行的。

3 討論

隨著功能基因組時代的到來，有必要了解這些新基因的功能及在發育過程中的表達模式。而整體原位雜交技術正好為了解胚胎發育過程中的術相比，整體原位雜交有以下優點：1)能夠直觀地觀察基因在整體中的時空表達分布，能很精確的反映基因表達的三維信息。2)可以同時分析多個組織塊、胚胎或不同發育階段的胚胎。

整體原位雜交技術最易出現的問題是高背景，低信號。為避免這一現象，在實驗過程中我們需要注意以下幾個方面：

3．1 蛋白酶K的處理時間

這一步是雜交成功與否的關鍵因素，蛋白酶K處理的目的是為了提高胚胎組織對探針的通透性，以便探針能夠有效地進入組織細胞內與mR—NA靶分子進行雜交。如果處理不足，則會導致探針不能有效地滲透至組織內，不能顯示雜交信號。整體原位雜交時，蛋白酶K處理的時間一般需要7-10min。其處理時間可根據胚胎的大小不同而定：E8～9＝8min、E10＝10min；在本實驗中，我們主要通過眼睛檢測蛋白酶K消化是否適度，當看見卵黃囊的碎片從胚胎體有脫落時，即可終止反應。延長蛋白酶K消化時間是為了更有利于探針的滲透，但是過之，則會導致低信號的發生，組織中的mRNA會因此彌散，被漂洗掉。可見，蛋白酶K消化處理是非常重要的一個步驟。

3．2 探針及抗體濃度

探針和抗體濃度的高低對于雜交信號的強弱以及背景的高低都有很大的影響。探針及抗體濃度大，則可以得到較強的雜交信號，但背景色有可能較深，影響信號的觀察。反之，在實驗中，可通過降低探針和抗體濃度來減少高背景。降低探針濃度可減少非特異性的雜交，而降低抗體濃度可避免非特異的顯色，避免高背景的現象。綜合我們研究的經驗，我們認為，在對交配后7～9d的小鼠胚胎進行整體原位雜交時，使用1、2 mg／L的探針濃度和1：2 000的抗體濃度是比較適度的。

3．3 漂洗

無論是探針雜交后的漂洗還是抗體孵育后的漂洗，都可以有效的降低顯色背景。因此，在探針雜交后和抗體孵育后都需要充分的漂洗。另外，可通過延長1h溶液1的漂洗以降低背景，同時在抗體漂洗后，將胚胎置于MABT4℃過夜，然后在顯色前漂洗1h，2次，此步尤其適合E10的胚胎。另外，雜交后使用RNaseA充分降解未雜交的RNA探針也是降低背景信號的有效方法之一。