五羥色胺和褪黑素對紅細胞懸浮液粘度及紅細胞形狀的影響

摘 要：探討五羥色胺(5-HT，serotonin)和褪黑素(melatonin)對紅細胞懸浮液粘度及紅細胞形狀的影響。建立五羥色胺溫育的紅細胞—血漿體系、紅細胞-HEPES緩沖溶液體系及褪黑素溫育的紅細胞-血漿體系、紅細胞－HEPKS緩沖溶液體系；觀察各體系中紅細胞懸浮液粘度的改變及其形態(tài)變化。用正常的紅細胞懸浮液作對照進行比較時發(fā)現(xiàn)，五羥色胺和褪黑素溫育后的紅細胞懸浮液粘度顯著下降；五羥色胺溫育后的紅細胞形狀呈梭形，而褪黑素溫育后的紅細胞形狀變化不明顯。結(jié)果提示：神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)對血液粘度有直接影響。這對于揭示血瘀癥的分子本質(zhì)和人體在多種生理及病理狀態(tài)下的血液流變學異常提供了實驗依據(jù)。

關鍵詞：五羥色胺；褪黑素；血液粘度；紅細胞形態(tài)；血瘀癥

中圖分類號：Q591．5

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2006)02-0118-05

五羥色胺和褪黑素是體內(nèi)兩種重要的激素，本實驗室研究曾表明褪黑素是體內(nèi)一種高效的氧自由基／羰基清除劑，而氧化和羰基緊張能造成紅細胞懸浮液粘度上升，本實驗旨在探索五羥色胺和褪黑素對血液粘度和紅細胞形狀的影響，并探討其可能的作用機理。

1 材料和方法

1．1 試劑與儀器

褪黑素由美國Sigma公司提供；五羥色胺購于瑞士Fluka公司；羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)購自上海生工生物工程有限公司；DV-Ⅲ錐板式粘度計為美國Brookfield公司生產(chǎn)；BX51-TF熒光顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)。

1．2 血液樣品

新鮮紅細胞、血漿(1．5 g／L肝素鈉抗凝)購于長沙市血液中心。每次實驗所用血漿和紅細胞均采用同一種血型，以減少不同血型對紅細胞聚集性的影響。紅細胞的壓積用HEPES緩沖液稀釋，嚴格控制在40％，以接近正常生理狀態(tài)下人血液中的紅細胞壓積。

1．3 褪黑素和五羥色胺的配制

稱0．212g五羥色胺(C¹⁰H¹²N²O·HClMr212．68)用HEPES緩沖溶液溶解定容至10mL配制成1×10^-1mol／L儲備液，儲存于0～4℃?zhèn)溆谩Ｓ梦辶u色胺儲備液稀釋成不同的濃度加入血液樣品中使其最終濃度分別控制在2×10^-8、1×10^-7、2×10^-7和2×10^-6mol／L。取0．116g褪黑素(C₁₃H₁₆N₂O₂Mr232．16)溶解于1．0 mL分析純乙醇中，然后用HEPES緩沖溶液定容至50mL，得到1×10_-2mol／L儲備液，儲存于0～4℃?zhèn)溆谩Ｓ猛屎谒貎湟合♂尦刹煌臐舛龋尤胙簶悠分惺蛊渥罱K濃度分別控制在2×10^-8、8×10^-8、2×10^-7和2×10^-6mol／L。

1．4 血液粘度的測定及塑性粘度的計算

將紅細胞分別置于血漿和HEPES緩沖溶液中，加入不同濃度的褪黑素和五羥色胺，于37℃水浴30min。對不同濃度的褪黑素和五羥色胺溫育后的紅細胞懸浮液用DV—Ⅲ錐板式粘度計測定不同剪切率(100—400 s^-1)下的表觀粘度，由Rheocalc 32軟件自動記錄。每一組剪切率下的塑性粘度由同一軟件的Casson方程計算給出。

1．5 紅細胞形態(tài)學觀察

將不同濃度的褪黑素和五羥色胺溫育后的血漿－紅細胞和HEPES—紅細胞懸浮液制成涂片，用熒光顯微鏡觀察紅細胞形狀的變化。結(jié)果顯示五羥色胺在2×10^-8mol／L和褪黑素在8×10^-8mol／L時的紅細胞形狀變化圖，其余濃度的變化與這兩個濃度相同。

1．6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)和標準差(means±s．d．)表示，兩樣本比較采用成組t檢驗．

2 結(jié)果

2．1 血液流變學指標的改變

測定五羥色胺溫育的紅細胞—血漿體系的粘度表明，不同剪切率下的表觀粘度的平均數(shù)隨著濃度的升高而降低(圖1A)，跟對照比較T值隨著濃度的升高而增加(表1)．塑性粘度在濃度為2×10^-8mol／L時，處理組比對照組有顯著地降低(t=4．24，P<0．05)，而1×10^-7mol／L和2×10_-7mol／L兩個濃度與對照處理的差異不顯著；濃度為2×10₆mol／L時，有高度顯著地降低(t=143．75，P<0．001圖1C)。經(jīng)五羥色胺溫育后的紅細胞－HEPES緩沖溶液體系的表觀粘度，處理組比對照組均有高度顯著地降低(圖1B、表1)。

經(jīng)五羥色胺溫育后的紅細胞－血漿體系中的紅細胞形狀變化，不如紅細胞－HEPES緩沖溶液中的變化明顯，經(jīng)腿黑素溫育后的紅細胞－血漿體系中的紅細胞形狀變化不明顯(圖4)。

測定褪黑素溫育的紅細胞-血漿體系的粘度表明，不同剪切率下的表觀粘度下降具有濃度依賴性，平均數(shù)隨著濃度的升高而降低(圖2A)，跟對照比較T值隨著濃度的升高而增加(表2)，除了2×10^-8mol／L以外，其它濃度處理均高度顯著地低于對照(圖2A)；同樣，塑性粘度除了濃度為2x10^-8mol／L以外，其它濃度處理均顯著或高度顯著地低于對照(圖2C、表2)；褪黑素溫育的紅細胞-HEPES緩沖溶液體系的表觀粘度除了最高濃度2×10^-6mol／L達到高度顯著水平以外，其余的3個低濃度均無顯著差異(圖2B、表2)。

2.2 紅細胞形態(tài)學改變觀察經(jīng)五羥色胺溫育后的紅細胞－HEPES緩沖溶液體系中的紅細胞，發(fā)現(xiàn)紅細胞的形狀變?yōu)樗笮?圖3B)；而經(jīng)褪黑素溫育的紅細胞-HEPES緩沖溶液體系中的細胞形狀變化不明顯(圖3C)。

經(jīng)五羥色胺溫育后的紅細胞-血漿體系中的紅細胞形狀變化，不如紅細胞—HEPES緩沖溶液中的變化明顯，經(jīng)褪黑素溫育后的紅細胞-血漿體系中的紅細胞形狀變化不明顯(圖4)。

3 討論

血瘀證與活血化瘀研究一直是傳統(tǒng)中藥學和中西醫(yī)結(jié)合研究中最為活躍的領域。傳統(tǒng)中醫(yī)學關于血瘀證的認識，如“血行失度”、“血脈不通”等，可有“內(nèi)結(jié)為血瘀”、“污穢之血為血瘀”、“離經(jīng)之血為血瘀”和“久病人絡為血瘀”等不同類型；西醫(yī)中臨床癥狀和體征有舌質(zhì)紫暗或瘀斑、痛有定處、瘕積聚等。血瘀證的實質(zhì)是血液粘度增高、血流緩慢等，血液處于“濃、粘、聚、凝”的高凝狀態(tài)，從而使全身或局部的血液循環(huán)和微循環(huán)發(fā)生障礙，而產(chǎn)生一系列疾病。在血液中存在以下幾種分子平衡系統(tǒng)：凝血因子－抗凝因子；前列環(huán)素－血栓素；內(nèi)皮素－降鈣素基因相關肽等。這些平衡系統(tǒng)受到各種體液激素的調(diào)節(jié)而在體內(nèi)保持著微妙的平衡關系，一旦這種平衡關系被打破，極有可能造成血液的淤積。在生理狀態(tài)下，它們經(jīng)神經(jīng)、體液和局部的正、負反饋的內(nèi)調(diào)節(jié)作用，在數(shù)量、活性和效應上是平衡的，維持著人體血壓、凝血、纖溶等血流動力學和血液流變學的正常；但在病理條件下，它們之間的動態(tài)平衡發(fā)生了改變，使血液處于高凝低纖溶狀態(tài)．中醫(yī)理論認為：“慢性惱怒致血瘀”。推測“慢性惱怒致血瘀”的原因與體內(nèi)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能發(fā)生紊亂導致各種激素的協(xié)調(diào)平衡關系被打破有關。本研究主要是利用紅細胞作為血瘀證的研究模式，對照以前所用的血小板作為血瘀證研究的主要對象，在研究對象上有所創(chuàng)新。

五羥色胺(5-HT)和褪黑素(melatonin)作為體內(nèi)兩種重要的激素，能引起紅細胞-血漿體系粘度的下降(圖1A，圖2A)。這兩種激素在體內(nèi)起著廣泛的作用，它們跟人的應激，晝夜節(jié)律，免疫功能等密切相關。其可能的作用機制是：五羥色胺和褪黑素是一種高效的氧自由基和羰基的清除劑，而羰基和氧化應激能引起紅細胞懸浮液粘度顯著上升。推測五羥色胺和褪黑素通過清除紅細胞表面的氧自由基和羰基，降低紅細胞的聚集性，增加紅細胞表面的負電荷，從而降低紅細胞懸浮液的粘度。五羥色胺主要存在于血液中血小板的致密體中，它的攝取與釋放跟血小板的聚集和凝血密切相關。本研究表明五羥色胺引起血液粘度和紅細胞形狀的顯著變化，暗示其可能在體內(nèi)各種因素(如剪切應力)的調(diào)控下，通過改變紅細胞形狀而順利通過毛細血管，引起血液粘度的下降和紅細胞形狀的改變(圖3B、4B)。

通過比較紅細胞懸浮液粘度和形狀在HEP-ES懸浮液和血漿中的不同變化(圖1A、B，圖2A、B，圖3B、C，圖4B、C)，可以看出血漿在保持血液粘度狀態(tài)和維持紅細胞正常形狀方面發(fā)揮一定作用。血漿中的蛋白如纖維蛋白原在凝血和介導紅細胞黏附上發(fā)揮著重要作用，血漿中的血小板和白細胞也可能在氧／羰基應激中被激活而引起血液粘度的上升。近來研究表明，五羥色胺和褪黑素能抑制白細胞的遷移和黏附性，推測它們可能在紅細胞-血漿體系中抑制了纖維蛋白原，血小板，白細胞對紅細胞的黏附性從而降低了血液粘度。

盡管激素被認為是影響血液粘度的一個重要因素，由于它們在體內(nèi)廣泛的生物活性，因此在整體動物體內(nèi)研究它們對血液粘度的影響較為復雜，國內(nèi)外研究的結(jié)果常有差異。本研究在體外建立一個比較簡便的模式去研究五羥色胺和褪黑素對血液粘度的直接影響，得到較為滿意的結(jié)果，至于五羥色胺和褪黑素在體外模式下的藥理作用機制與體內(nèi)是否一致有待于更進一步深入地研究。