一種簡便快速的聚合酶活性實時檢測新方法

摘 要：基于雙鏈DNA結合染料能特異嵌入雙鏈DNA發出熒光的原理，發展了一種實時檢測DNA聚合酶活性的簡便方法。在檢測過程中，聚合酶的聚合反應進程被實時轉換為熒光信號，通過監測熒光強度的變化實時檢測聚合酶的活性及藥物對聚合酶活性的影響。該方法不需要對DNA進行放射性同位素標記和熒光標記。也不需要聚丙烯酰胺凝膠電泳和聚合酶鏈式反應，是一種簡便、快速的聚合酶活性實時檢測新方法，為研究抗腫瘤藥物對聚合酶活性的影響提供了一種簡捷方法，也將為相關疾病診治和藥物篩選提供一種新的思路。

關鍵詞：聚合酶；雙鏈DNA結合染料；實時監測；活性

中圖分類號：Q55

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2006)02—0113—05

聚合酶作為一種重要的工具酶，廣泛應用于基因測序，載體制備及基因克隆等一系列重要的分子生物學技術之中，而且由于其在核酸的復制、修復、重組等生命過程中的重要作用，聚合酶已成為引人注目的藥物靶標，特別是聚合酶活性的檢測對腫瘤診斷和治療療效觀察有重要的價值，有望成為一種有前途的腫瘤標記物。目前研究聚合酶活性的傳統方法主要是放射性同位素標記結合凝膠電泳，操作復雜費時，也不能提供實時信息。近來發展了一些不需放射性標記的新方法用于聚合酶活性的研究，如PCR的方法能實時研究耐高溫聚合酶，但是對不耐高溫的聚合酶則不能有效分析；BrakmannS等和SummererD等發展的標記dNTP的方法和標記寡核苷酸的分子信標方法，需要對聚合酶反應的底物直接進行熒光標記，實驗成本較高；另外，Tveit應用染料Picogreen檢測DNA聚合酶活性，無須對底物標記，但這種染料是昂貴的，而且采用的是終點測定法研究酶活性，無法提供實時、動態的聚合過程及酶活性信息。

本文發展了一種簡便、快速的聚合酶活性實時檢測新方法。基于引物延伸反應和雙鏈DNA結合染料實現了聚合酶活性的實時研究，操作簡單、快捷、成本低。用此方法我們實時監測了一種廣泛應用于生物醫學工程領域的Klenow Fragment(exo－)(簡稱KF－)DNA聚合酶的活性，并研究了3種常用的抗腫瘤藥物對其活性的影響。這種簡便的聚合酶活性檢測方法有望為臨床疾病診治和藥物篩選提供一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1．1 材料

引物及模板由大連寶生物公司合成，序列見表1，KF－(5U／μL，Fermentas)，SYBR Green I(上海開放科技有限公司)，dNTP Mixture(Takara)，Tris(Sigma)，二硫蘇糖醇DTY(Bebco)，丙烯酰胺(Sigma)，甲叉雙丙烯酰胺(Sigma)，尿素(BBl)，其它試劑均為國產分析純．實驗所用水均為過濾除菌的高純水，實驗器皿均經過高溫滅菌。

1．2 方法

1．2．1 熒光測定

熒光測定在美國Perkin Elmer LS-55熒光分光光度計上進行，本文選用雙鏈DNA結合染料SYBR Green I，熒光強度的測定用497 nm光激發，在520 nm處檢測，儀器的入射狹縫與發射狹縫都設為2．5 nm，美國Amersham恒溫水浴控制反應溫度均為37．0℃，樣品的反應體積均為200μL。

1．2．2 實時監測聚合酶的活性

配制溶液A：50mmol／L Tris-HCl(pH 8．0)，5mmol／L MgCI₂，1mmol／L DTY，50μmol／L dNTPMixture，1×的SYBR GreenI，100nmol／L的模板N1和100nmol／L引物N2.在熒光分光光度計上待溶液熒光值穩定后，再加入2．5U的KF-，實時監測熒光強度的變化。同時配制了3種對照溶液B、C、D，來驗證KF－的活性，溶液B、C、D與溶液A相比，分別未加KF－、MS²⁺離子和dNTP Mixture，加入2．5U的KF-后，實時監測熒光強度的變化。

1．2．3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

使用傳統電泳方法來驗證聚合反應，上述4種反應樣品在95℃變性5min，然后在0℃驟冷5s，用含7％尿素的20％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染分析，銀染步驟參照文獻進行。

1．2．4 聚合酶活性定量分析

改變溶液A中加入的KF－的量，使其終濃度分別為25、20、12．5、7．5、5、2．5、1．25U／mL，并實時監測熒光強度的變化，按文獻計算反應初速度，得出聚合反應初速度與酶濃度的相關性。

1．2．5 聚合酶延伸特異性實驗

將溶液A中的100nmol／L的引物N2片段分別換為等量的3＇端單堿基不匹配引物N3、N4、N5，配制溶液E、F、C，分別加入2．5U的KF—后，實時監測熒光強度的變化，并將反應初速度進行歸一化處理，研究聚合酶延伸的特異性。

1．2．6 抗腫瘤藥物對聚合反應的影響

在溶液A中分別加入不同濃度的博萊霉素、絲裂霉素或順鉑抗腫瘤藥物，然后再加入2．5U的聚合酶KF－，實時監測熒光強度的變化，計算它們的反應初速度，并以在相同條件下，不加藥物的聚合酶KF－的反應初速度作為對照，探討藥物對聚合酶活性的影響作用。

2 結果與分析

2．1 原理

染料對聚合酶活性的實時監測原理如圖1所示。DNA聚合酶按模板DNA上的核苷酸順序，將互補的dNTP逐個加到引物3＇-OH末端，并促進3＇-OH與dNTP的5＇-P0₄形成磷酸二酯鍵，從而延伸聚合DNA鏈。同時雙鏈DNA結合染料(SYBRGreen I)，與新生的雙鏈DNA結合，發出熒光。隨著聚合反應的進行，嵌人雙鏈的染料增多，熒光信號增強，從而實現聚合酶活性的實時監測。

2．2 實時監測聚合酶的活性

聚合酶KF—活性的實時監測見圖2。圖中曲線1是在溶液A中加入KF－的熒光強度的時間掃描圖，在t₀處加入KF－后，發現隨著時間的增加，熒光強度逐漸增強。這是由于在聚合酶作用下，dNTP被逐個加到引物的3，末端，形成雙鏈，與此同時，染料SYBR Green I嵌入雙鏈，產生持續增強的熒光，這與上述原理所述一致。在溶液中不存在KF—，Mg2’離子和dNTP Mixture的情況下(溶液B、C、D)，在t₀處加入KF-后，熒光強度沒有明顯的變化(曲線2-4)，說明在這些溶液中沒有聚合反應發生，也說明了KF—聚合酶必須有Mg²⁺離子，dNTP Mixture的參與才能發揮酶活性。以上結果表明，曲線1中的熒光強度的增強確實是由于模板與互補引物在聚合酶KF－的作用下發生了延伸反應。

在實驗中還設計了傳統的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來進一步驗證聚合反應，結果見圖3。條帶1是模板N1和引物N2的混合液，條帶2是溶液A反應樣品，條帶3～5分別為溶液B、C、D反應樣品。從條帶2和條帶1比較可以清楚看出，引物帶N2消失，并且在模板上方出現了一條新的聚合產物帶(為了區分聚合反應生成的產物和原有的模板，設計的引物的5，端相對模板N1多出2個堿基“AG\"，因此條帶2的模板上方的新帶，即為引物在聚合酶的催化下發生延伸反應而形成的聚合產物)。在條帶3～5中，發現當反應物里分別缺少KF－、Mg₂₊離子或dNTP Mixture時，均沒有新的聚合產物帶的出現，說明沒有聚合反應發生。通過電泳，再次說明了圖2曲線1中熒光強度的增加的確是由于發生了聚合反應形成的。

2．3 聚合酶的定量分析

利用上述監測方法，實時考察了一系列不同濃度的聚合酶催化的延伸反應。圖4(a)是在溶液A中分別有5、4、2.5、1.5、1、0.5、0.25U的聚合酶KF－的時間掃描圖。反應體積為200μL，則聚合酶的終濃度分別為25、20、12．5、7．5、5、2．5、1．25U／mL。隨著聚合酶濃度的增加，聚合反應的速度也越大。按文獻計算出各濃度時的聚合反應初速度(Vo)，圖4(b)給出了聚合反應初速度(yo)與KF－聚合酶濃度(C)之間的關系，發現酶濃度從25U／mL到1．25U／mL時，聚合反應初速度與酶濃度成線性關系(Vo＝0．025 1C－0．0268，線性相關系數R²=0．9968)。此方法的檢測下限為1．25 U／mL(在已有檢測聚合酶活性文獻中，很少對檢測下限進行研究)。在臨床診斷中，根據反應初速度，在聚合反應初速度(Vo)與酶濃度(C)的線性方程里，可以很方便的進行酶濃度的測定。

2.4 聚合酶特異性實驗

DNA聚合酶的聚合特異性，對相關研究與應用有重要影響。我們考察了3＇端單堿基不匹配引物的聚合反應，并用完全匹配的引物作對照，參照文獻對各反應初速度進行歸一化處理，結果如圖5所示：發現當引物3＇端單堿基不匹配時，沒有明顯的聚合反應。由此可知，說明KF－對底物有很好的特異性，同時也看出此方法對于聚合酶特異性的研究也非常方便快捷。

2．5 抗腫瘤藥物對聚合酶活性的影響

博萊霉素、絲裂霉素和順鉑是常用的抗腫瘤藥物，通過實驗分別考察了這3種藥物對聚合酶KF－活性的影響，發現當絲裂霉素的濃度為30mg／L時，KF－的活性比沒有加藥物時抑制了50％左右，說明絲裂霉素對聚合酶活性有較強的抑制作用；而順鉑的濃度為700mg／L時，聚合酶的活性比沒有加藥物時才抑制50％左右，說明順鉑在高濃度時才體現出明顯的抑制作用；而博萊霉素的濃度在700mg／L時，對聚合反應都無明顯影響。由此可知，使用本方法，可方便快捷的研究藥物對酶活性的影響，將為抗腫瘤新藥的開發和篩選提供有益的信息。

3 結論

本文發展的DNA聚合酶活性的實時檢測方法，有以下優點：

1)與傳統的分析聚合酶活性的方法相比，該方法不需放射性同位素標記和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，操作簡單方便。

2)與現有的熒光分析方法相比較，該方法不需對反應底物進行直接熒光標記及生物化學修飾，成本低。

3)此方法可實時分析聚合酶的活性，與終點分析法相比，更加真實準確地反映了聚合反應動態過程信息。

4)此方法可方便快捷地研究藥物對聚合酶的影響作用，為以聚合酶為靶標的新藥的開發及篩選提供一種新的手段和方法。