Ｈｅｌａ細(xì)胞導(dǎo)入ＴＲＩＭ４５基因后的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

摘 要：為了確定TRIM45基因的功能和作用機(jī)理，將其轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。研究采用雙向凝膠電泳的方法分別對(duì)轉(zhuǎn)入pCMV-Tag2B空載體和重組質(zhì)粒pCMV-Tag2B-TRIM45的Hela細(xì)胞全蛋白進(jìn)行分離，利用PDQUEST7．2軟件分析，鑒定得到15個(gè)差異點(diǎn)，包括8個(gè)上調(diào)點(diǎn)和7個(gè)下調(diào)點(diǎn)。為進(jìn)一步研究TRlM45基因的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Hela細(xì)胞系；蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向凝膠電泳；質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：Q297；Q51

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847(2006)02-0103-06

蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代蓬勃發(fā)展的技術(shù)體系，其特點(diǎn)是采用高通量、高分辨率的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，全景式的研究在特定條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，并由此在蛋白質(zhì)水平上獲得對(duì)組織發(fā)育、疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過(guò)程整體而全面的認(rèn)識(shí)。高分辨率的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(tWO-dimentionalelectrophoresis，2DE)和高靈敏度質(zhì)譜(Massspec－trometry，MS)技術(shù)相結(jié)合，是蛋白質(zhì)水平研究的強(qiáng)有力武器。

RBCC／TRIM蛋白參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞凋亡等多種生理途徑，還與多種疾病的發(fā)生相關(guān)。人TRIM45編碼一個(gè)新的RBCC／TRIM家族蛋白，本研究小組早期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它可以抑制Elk-1和AP-1蛋白轉(zhuǎn)錄活性，提示它可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。在對(duì)TRIM45功能和作用機(jī)制不了解的情況下，本文從蛋白質(zhì)組學(xué)方法人手對(duì)該基因進(jìn)行研究。因?yàn)镠ela細(xì)胞為人宮頸癌細(xì)胞系，采用此細(xì)胞系能更真實(shí)反映TRIM45在人體內(nèi)的功能。我們分別收集獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Tag2B和重組質(zhì)粒pCMV-Tag2B-TRIM45的Hela細(xì)胞，提取細(xì)胞全蛋白，用固相pH梯度SDS－聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳分離，銀染顯色，獲得重復(fù)性和分辨率較好的雙向凝膠電泳圖譜。運(yùn)用PDQuest7．2軟件分析，選取2倍以上的差異點(diǎn)，膠內(nèi)酶解后經(jīng)MALDI-TOF鑒定。鑒定出的蛋白對(duì)于了解和解釋TRIM45在細(xì)胞中的功能和作用機(jī)制將很有幫助。

1 材料和方法

1．1 試劑

固相pH梯度干膠條(pH3～10L，180mm×3mm×0．5mm)、載體兩性電解質(zhì)(pH3～10)、IPG緩沖液、覆蓋液、過(guò)硫酸銨、PMSF、考馬斯亮藍(lán)R-350等產(chǎn)品購(gòu)自Pharmacia公司；丙烯酰胺、N，N＇-亞甲基雙(丙烯酰胺)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、尿素、甘油、CHAPS等為Amresco公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇(DTF)、碘乙酰胺、牛血清白蛋白(BSA)為Sigma公司產(chǎn)品；四甲基乙二胺(TEMED)為SERVA公司產(chǎn)品；低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為上海伯奧生物制品公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1．2 材料

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Tag2B的Hela細(xì)胞6皿(直徑10cm)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV-Tag2B-TRIM45的Hela細(xì)胞6皿(直徑10cm)，由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心臟發(fā)育實(shí)驗(yàn)室提供。

1．3 細(xì)胞總蛋白質(zhì)的制備

培養(yǎng)的Hela細(xì)胞用Dehanks溶液洗滌3次，每一培養(yǎng)皿中加入60μL的裂解液(8mol／L的尿素，2mol／L硫脲，65mmol／LDTY，0．5mmol／LPMSF，4％ W／V CHAPS，1％ NP40)，在冰上用細(xì)胞刮刮動(dòng)細(xì)胞使裂解液與細(xì)胞充分接觸，4℃裂解20min，收集裂解液與細(xì)胞及其裂解產(chǎn)物的混合物，4℃放置30min，每隔5min輕微震蕩一次，12000r／min離心30min，棄沉淀取上清，Brad-ford法測(cè)定蛋白含量后，等量(250μg)分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 固相pH梯度雙向凝膠電泳

蛋白質(zhì)(銀染蛋白質(zhì)的上樣量250μg)溶液與水化液(8mol尿素，4％CHAPS，18mmol／LDTY，0．5％ IPGbuffer pH3~10，痕量的溴酚藍(lán))混合至總體積為350μL，12000r／min離心10min，取上清，上樣。兩個(gè)樣品同時(shí)在20℃自動(dòng)進(jìn)行水化和聚焦，總電壓時(shí)間積為44420V，1h，其中在30V低電壓水化14h，然后經(jīng)過(guò)500V，1h，1000V，1h，8000V梯度0．5h，最后穩(wěn)定在8000V下進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦結(jié)束后，將膠條進(jìn)行兩步平衡，第二向采用分離膠濃度為11．5％，濃縮膠濃度為4．8％的不連續(xù)SDS-PAGE垂直平板電泳，每塊膠板25mA恒流電泳，然后銀染顯色。采用清華紫光掃描儀成像系統(tǒng)獲取圖像，利用PDQuest 7．2(Bio-Rad)圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行強(qiáng)度校正、點(diǎn)檢測(cè)、背景消減、匹配等分析。

1．5 膠內(nèi)酶解

選取識(shí)別為2倍以上的差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，按Fernandez等和Gharahdaghi等的方法稍做修改來(lái)進(jìn)行。蛋白質(zhì)點(diǎn)切下后脫色、脫水、干燥后加入5μL1g／L的胰蛋白酶液，4℃放置30min，使膠塊完全泡脹，再加入25μL覆蓋液(25mmol／L的碳酸氫銨溶液)，37℃保溫18h之后加入50μtL萃取液(67％乙腈，0．1％三氟乙酸)37℃保溫1h，超聲萃取，重復(fù)2次，每次15min。合并上清和提取液，濃縮至5μL左右，用Milliproe公司的ZIPTIPTMC18微柱脫鹽后與CCA(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid)基質(zhì)液混合，輕微震蕩后吸取1μL均勻點(diǎn)樣于不銹鋼點(diǎn)樣板上，自然風(fēng)干以供分析。

1．6 質(zhì)譜鑒定

制備好的樣品用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的Voyager-DET”SRT-MALDI-TOF-MS生物質(zhì)譜－I工作站進(jìn)行分析。操作模式為反射，延遲提取，正極性，手動(dòng)控制，加速電壓20000V，離子延遲提取時(shí)間為100ns，反射電壓比為l：12，獲取質(zhì)量范圍為1000—3400Da，激光點(diǎn)擊數(shù)為每圖譜50次，數(shù)字化起始時(shí)間為46．292ns，Binsize為0．5nS，Vertical scale為500mV，Vertical offset為0．5％，Input bandwidth為500 MHz。質(zhì)譜使用胰蛋白酶自動(dòng)降解離子峰作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校正，獲得肽質(zhì)量指紋圖。

1．7 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢

獲得的混合物肽片段數(shù)據(jù)通過(guò)因特網(wǎng)在http：//www．expasy．org上搜索SWISS-PROT和TrEMBL的數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索參數(shù)如下：物種為人，輸入?yún)⒖嫉入婞c(diǎn)和肽片段質(zhì)量(由圖象分析得到)，等電點(diǎn)誤差為±1個(gè)pH單位，蛋白質(zhì)質(zhì)量誤差為±20％，使用單一同位素質(zhì)量，最大允許的肽質(zhì)量誤差為±50μg／g，肽片段以正離子形式存在，半胱氨酸為脲甲基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys)，每個(gè)肽片段允許有2個(gè)不完全裂解位點(diǎn)，半胱氨酸可能以丙酰胺-半胱氨酸的形式存在，最少匹配的肽片段為4，甲硫氨酸以氧化態(tài)存在。

2 結(jié)果

2．1 雙向電泳圖譜

通過(guò)2D技術(shù)分離得到兩組樣品的全蛋白質(zhì)圖譜，每組中選取3次重復(fù)性好的圖譜用PDQuest7．2軟件進(jìn)行匹配分析，發(fā)現(xiàn)其中有15個(gè)顯著性的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)(見(jiàn)圖1、表1)。

2．2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜分析

切取平行膠上15個(gè)相應(yīng)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)膠內(nèi)原位酶解后進(jìn)行MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜測(cè)定，并以酶自動(dòng)降解峰(m／z＝1993．9772)進(jìn)行校正。選取3對(duì)重復(fù)性好的圖譜，用PDQuest7．2軟件分析，選取2倍以上的差異點(diǎn)進(jìn)行酶解鑒定，所鑒定到15個(gè)差異點(diǎn)見(jiàn)表1。圖2為蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜。

3 討論

為了研究TRIM45基因的功能，本文比較了轉(zhuǎn)入空載體和TRIM45重組載體的Hela細(xì)胞的全蛋白雙向凝膠電泳圖譜，分析鑒定獲到了15個(gè)與TRIM45基因表達(dá)相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，以轉(zhuǎn)入空載體的Hela細(xì)胞的蛋白圖譜為空白對(duì)照，得到了8個(gè)上調(diào)點(diǎn)和7個(gè)下調(diào)點(diǎn)。

上調(diào)的蛋白質(zhì)中，26S蛋白酶的亞基6A(26S protease regulatory subunit 6A)是人紅血球中26S蛋白酶的一個(gè)組成部分，26S蛋白酶主要參與泛素化蛋白質(zhì)的ATP依賴性降解，調(diào)節(jié)亞基6A主要調(diào)節(jié)26S蛋白酶的ATP依賴性和底物特異性。

腎素結(jié)合蛋白(renin binding protein)通過(guò)和腎素結(jié)合，形成一個(gè)高分子量的二聚體，抑制腎素的活力。該蛋白只和腎臟內(nèi)的腎素結(jié)合，和腎臟內(nèi)的酸性蛋白酶以及腎臟外腎素不能結(jié)合，說(shuō)明它在腎臟中有重要的功能。有研究發(fā)現(xiàn)腎素結(jié)合蛋白在泌素瘤中表達(dá)增高，它可能和腫瘤發(fā)生有某些關(guān)系。腎素結(jié)合蛋白還是N-乙酰葡糖胺的表型異構(gòu)酶，可以催化N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)化為乙酰甘露糖胺。

Ras-related protein Rab-9A和Ras-relatedproteinRab-13都是Ras家族的GTP酶，該家族主要參與內(nèi)涵體和高爾基體之間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化，細(xì)胞因子的產(chǎn)生、趨化，以及囊泡運(yùn)輸和胞吞過(guò)程中也行使作用。Ras—relatedprotein Rab-9A，具與GTP的結(jié)合的能力，可以激活GTP酶的活性，參與小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Ras-related protein Rab-9A是一個(gè)血清廣譜抗病毒藥物作用的新靶標(biāo)。有研究稱Ras-related protein Rab-13在緊密連接的形成中參與細(xì)胞極性運(yùn)輸。

蛋白磷酸酶(Protein phosphatase)是PP2A相關(guān)蛋白的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化酶，在細(xì)胞內(nèi)起著重要的作用，參與微管的組裝、細(xì)胞凋亡、TNF腫瘤壞死信號(hào)傳導(dǎo)通路并激活c-Jun信號(hào)途徑氮端激酶。該酶還通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白脫乙酰基酶的磷酸化來(lái)控制基因的轉(zhuǎn)錄。

下調(diào)的蛋白質(zhì)中，a-烯醇酶(Alpha-enolase)存于胞漿，在三羧酸循環(huán)中催化磷酸烯醇式丙酮酸的代謝，同時(shí)還作為缺氧誘導(dǎo)因子10的靶基因。研究表明，它與肺癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤、消化道腫瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。更有研究證明a-烯醇酶是一候選的血漿酶原受體，在轉(zhuǎn)移性頭頸部腫瘤中表達(dá)水平明顯高于為轉(zhuǎn)移的腫瘤，提示該酶可激活蛋白酶及選擇性的降解基質(zhì)成分而介導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

鈣網(wǎng)織蛋白3(Calreticulin 3)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的一種鈣結(jié)合蛋白，參與鈣在細(xì)胞內(nèi)的儲(chǔ)存以及蛋白質(zhì)分子的折疊合和錯(cuò)誤折疊蛋白的重折疊，也是一種與維生素K依賴性凝血因子相結(jié)合的抗栓劑，可以刺激內(nèi)皮質(zhì)釋放氮氧化物，抑制血栓形成。

連接蛋白(link protein)能增強(qiáng)并穩(wěn)定糖胺聚糖與透明質(zhì)酸的相互作用，是透明質(zhì)酸與糖胺聚糖連接所必需的橋梁蛋白。新的研究結(jié)果表明，連接蛋白還參與透明質(zhì)酸和多能聚糖連接的形成。

鋅指蛋白在生物體內(nèi)具有重要功能，參與各種生理活動(dòng)。鋅指蛋白138(Zinc finger protein138)含有5個(gè)KRAB框和4個(gè)C2H2結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其可能是個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。研究者根據(jù)鋅指蛋白138(Zinc finger protein 138)基因所在的位置，預(yù)測(cè)該蛋白與一些惡性疾病相關(guān)，例如威廉姆斯綜合癥和裂手。

胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(insulin-likegrowth factor binding protein)與胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ和Ⅱ結(jié)合隨血液流動(dòng)，這種結(jié)合會(huì)影響胰島素樣生長(zhǎng)因子也細(xì)胞表面受體的結(jié)合以及該因子的壽命。

這些蛋白質(zhì)多數(shù)都跟腫瘤發(fā)生有關(guān)或者相關(guān)，它們表達(dá)情況的變化提示著TRIM45基因在腫瘤發(fā)生重發(fā)揮某種作用，它的作用可能要通過(guò)上面得到的某些基因?qū)崿F(xiàn)，或者TRIM45它的作用影響了其他腫瘤相關(guān)基因的活性和表達(dá)情況。另外，我們得到的上調(diào)蛋白中Ras-related proteinRab-9A和Ras-related protein Rab-13都是MEPK信號(hào)通路的上游因子，這跟我們前面實(shí)驗(yàn)得到的TRIM45基因抑制MEPK信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Elk-1和AP-1蛋白轉(zhuǎn)錄活性結(jié)果相悖，我們可以用細(xì)胞的反饋調(diào)節(jié)來(lái)解釋，這一點(diǎn)還需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，通過(guò)雙向凝膠電泳分別對(duì)轉(zhuǎn)入pCMV-Tag2B空載體和重組質(zhì)粒pCMV-Tag2B-TRIM45的Hela細(xì)胞全蛋白進(jìn)行分離、分析，成功鑒定到了15個(gè)TRIM45基因相關(guān)的蛋白，這些蛋白的鑒定對(duì)于確定TRIM45基因的功能和作用機(jī)制具有一定指導(dǎo)意義，也為進(jìn)一步研究TRIM45基因奠定了基礎(chǔ)。