Ｇ_β類似蛋白－ＷＤＲ２６對細胞增殖的影響

摘 要：WD40重復序列蛋白是一類結構保守、功能復雜的蛋白。關于此類蛋白和細胞內信號傳導途徑的研究顯示，該家族成員很可能通過調控胞內信號轉導而影響細胞基本生命活動。在此前的研究中，我們報道了一個新基因WD40 repeatprotein 26的克隆。其初步研究結果顯示WDR26蛋白與MAPK信號途徑的負調控相關。在最近的研究中，我們構建了穩定轉染pCMV－WDR26表達載體的HeLa細胞系，結果顯示WDR26蛋白在HeLa細胞系中的過度表達，能夠促進細胞分裂，加快細胞的倍增速度。因此，WDR26很可能具有通過MAPK信號途徑調節細胞增殖的功能。

關鍵詞：WDR26蛋白；MAPK信號途徑；細胞增殖

中圖分類號：Q753

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2006)02－0123－05

WD40重復序列蛋白(WDR)家族的成員廣泛地存在于真核生物中，其中研究最為深入的是G蛋白的β亞基(C_β)。此類蛋白以4～16個保守的WD重復序列為家族結構標志。一個典型的WD重復序列由大約40個氨基酸組成，包括氨基端的GH、羧基端的WD和以Trp-Aspmotif為核心的中間序列。結構分析說明，該家族成員具有保守的序列及空間結構，WD40蛋白質家族之所以廣受關注，不僅因為引人注目的保守性空間結構，而且因為這一龐大家族所具有的異乎尋常的功能多樣性——其成員在真核生物中廣泛存在，影響著細胞生命活動的方方面面。參與信號傳導過程的WDR蛋白，除了研究得最為詳盡的G_β外，還有磷酸化酶亞基、蛋白激酶C的錨定蛋白以及多個信號途徑的調控因子，如hPIP2等。在RNA合成過程中，一些WDR蛋白是snRNP顆粒的組成部分。而作為轉錄調控因子的WDR蛋白則包括TATA-box結合復合體的TFIID亞單位。此外該家族成員還涉及從細胞骨架構建、紡錘體組裝、小泡形成和運輸，到細胞分裂的調控及霉菌中硫代謝的調控等細胞生命活動。

在此之前，我們報道過關于WDR家族一個新成員WD40 repeat protein 26(WDR26)的初步研究工作。其結果顯示WDR26蛋白具有高度進化保守性。該蛋白包含5個WD40重復序列，與該家族成員——PAK抑制蛋白hPIP1具有相似的蛋白結構。表達分析說明WDR26在成體和胚胎期的多數組織中都有表達，因此很可能與多類細胞的基本生命活動相關。而進一步的轉錄激活活性分析顯示，該蛋白能夠抑制有絲分裂活化蛋白激酶(MAPK)信號途徑的效應因子——SRE和Elk－1的轉錄活性，很有可能對MAPK信號途徑起到負調控作用。

MAPK信號途徑是細胞信號傳導過程的重要組成部分。目前的研究表明，MAPK將G蛋白耦聯的受體等膜轉導蛋白與其細胞內的關鍵調控靶蛋白聯系起來，從而介導胞外的多種信號，如胰島素信號、表皮生長因子等，并將這些信號級聯放大后傳遞給相應的下游因子，通過激活包括SRE、ELK-1、c-Jun、c-fos、MEF2、ATF2，等在內的多種轉錄因子，最終開啟細胞特定功能基因的表達，從而調控細胞的生存及對外界的適應能力。在對細胞增殖的調節中，MAPK表現出正負兩方面的調節活性。ERKl／2可通過氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ(一個嘧啶合成限速酶)的磷酸化作用來刺激DNA的合成。此外，ERK很有可能通過一些MAP—KAPK，如細胞周期抑制性激酶MYTl，來促進細胞周期進程。同時也可以通過激活蛋白激酶p90Rsk使減數分裂細胞停留在分裂Ⅱ中期。ERK還可以通過激活APl活性，誘導產生細胞周期蛋白D1，從而間接刺激細胞增殖。

基于WD40家族的保守性結構特征，其家族成員(如C蛋白β亞基，hPIPl)的重要生物學功能，以及此前研究結果所揭示WDR26的基本特性以及它與MAPK信號途徑的潛在關系，我們相信該蛋白在細胞的基本生命活動中起著重要的調控作用。因此，在本文中我們進一步分析WDR26對于細胞增殖過程的影響。

1 材料和方法

1．1 細胞培養、細胞生長計數與流式細胞儀分析

生物安全柜及CO₂培養箱(37℃／5％ CO₂)均購自Forma公司。含氨芐青霉素(100mg／L)(BBl)和鏈霉素(100mg／L)(BBl)以及10％胎牛血清(杭州四季青公司)的DMEM培養基(GIBICBRL)，PBS(GIBIC BRL)，胰酶(0．05％)(GIBICBRL)，G418(Clontech)等分別用去離子水配制并按相應要求滅菌或濾菌。細胞復蘇、接種、傳代、凍存均按常規操作進行。

將HeLa細胞接種于DMEM培養基(無抗生素，無胎牛血清)的10cm細胞培養皿中，培養過夜。使用磷酸鈣轉染方法進行pCMV-WDR26以及對照質粒pCMV(均為10μg)的轉染。將100μL2．5mol／LCaCl2與25μg質粒DNA在室溫下混合；用移液器將等體積的2×HEPES鹽溶液吹打起泡后，將以上2×鈣-DNA溶液逐滴加入，靜置1min；將磷酸鈣－DNA懸液轉移至上述單層細胞的培養基中，培養過夜。除去培養基，用1×PBS洗細胞兩次，更換含氨芐青霉素和鏈霉素以及10％胎牛血清的DMEM培養基，并使用300、200、100mg／L的梯度濃度進行G418的篩選，3d更換一次培養基。穩定轉染pCMV-WDR26的HeLa細胞，使用含100mg／L濃度G418的DMEM培養基維持，實驗時接種于24孔板(每孔1×104個細胞)，分別于接種后48、72、96、120h將細胞用胰酶消化，并按1：10或者1：100稀釋后進行細胞數目計數。使用標準細胞計數板，每次計算10個方格的細胞總數×1000二細胞數目／mL。每次計數取3個樣品，重復實驗3次，取平均值，繪制細胞生長曲線，計算細胞倍增時間。

按照上述方法接種穩定轉染pCMV-WDR26的HeLa細胞系于6孔板，每孔1×10⁶個細胞，培養過夜后將細胞用胰酶消化法收獲，并離心后進行流式細胞儀分析。

1．2 抗原簇的位點分析與抗體的制備及純化

WDR26抗原簇位點分析使用DNAstar軟件進行。將0．8mg抗原肽溶于0．5mL生理鹽水中，先與弗氏佐劑(購自Sigma公司)在注射器中推成乳劑(1：1)，在第1d和第3d分別對新西蘭大白兔(購自中南大學湘雅醫學院)進行背部皮下免疫注射，分散10～20個點；在第28d再將溶于0．5mL生理鹽水中的0．8g抗原肽與非完全弗氏佐劑(購自Sigma公司)在注射器中推成乳劑(1：1)，第3次進行背部肌肉多點注射，第30天取血。兔血放在4℃冰箱中靜置過夜，以3 000r／min離心10min，取血清分裝保存于－80℃下。通過印記親和吸附法純化抗體。

1．3 Western Blotting

收獲一個10cm細胞培養皿(細胞密度80％)中的細胞，使用MRCgene公司的試劑盒一次性制備蛋白質、DNA和RNA(操作步驟按公司說明進行)。蛋白質濃度測定按照Bradford方法進行。

按照標準程序制備10％SDS—聚丙烯酰胺凝膠，取10μL(50／xg)蛋白樣品溶液，用等體積的2μSDS凝膠加樣緩沖液稀釋，95℃水浴3min，以使蛋白質變性，按順序用微量注射器點樣，接通電源，恒壓96V電泳，溴酚藍跑過積層膠后，恒定電壓150V。直到溴酚藍遷移到距膠的底部1cm處時，即停止電泳。

PVDF膜(購自Millipore公司)依次用甲醇預處理15s，去離子水浸潤5min，轉膜緩沖液浸潤5～10min。使用半干電轉法(北京六一儀器廠，DYCP-40C)把蛋白質轉到PVDF膜上，穩流80mA(2．5 mA／cm²)，電轉1．5～2．0h．凝膠經考馬斯亮藍染色，膜經1×麗春紅染色，以確認轉膜效果。在膜上作好標記后，用TBST漂洗數次，除去麗春紅。

實驗前用TBST(含1％脫脂奶粉)將膜在4℃下封閉過夜(緩慢搖動)。用TBST的稀釋一抗(WDR26特異性多克隆抗體，1：10／His－Tag單克隆抗體，1：1 000，Novageu)將以上制備的膜在室溫下孵育2h。膜用TBST漂洗3次，每次20min。用TBST稀釋的二抗(HRP耦聯的羊抗兔IgG單克隆抗體／HRP耦聯的羊抗鼠IgG單克隆抗體，Santa Cruz Biotechnology)按1：1500稀釋后，將膜孵育1h；TBST漂洗3次，每次20min；TBS漂洗30min。用新配制的按1：50稀釋的DAB(Amresco，E885)顯色20min(按照產品說明進行)，得到較好的信號-背景對比效果后用TBS中止反應。

2 結果與討論

2．1 抗原簇的位點分析與抗體的制備

WDR26抗原簇位點分析使用DNAstar軟件進行，結果如圖1．其中親水性較高、與家族基因的同源度較小的一段表面肽段(120aa－140aa)被選用作為抗原。我們利用化學合成的多肽為抗原，制備了WDR26的多克隆抗體，并利用抗原吸附的方法對血清進行了純化。

2．2 pCMV-WDR26穩定轉染細胞系的鑒定

為了對WDR26進行進一步研究，我們用該抗體對穩定轉染pCMV-WDR26的HeLa細胞系進行了鑒定。將從穩定轉染pCMV-WDR26的HeLa細胞系及穩定轉染pCMV的對照細胞系中提取的總蛋白轉印到PDFV膜上，再分別用純化后的WDR26特異性抗體和anti-Flag單克隆抗體對其進行Westernblot分析(圖2)。結果說明該純化抗體表現出較好的特異性，從而證明了穩定轉染pCMV-WDR26的細胞系已經成功建立。在pCMV-WDR26穩定轉染的細胞系中，WDR26的表達明顯強于對照細胞系中WDR26的表達。這說明HeLa細胞中存在內源性WDR26蛋白，而我們轉染的質粒則增強了這一蛋白的表達。

2．3 WDR26對細胞生長的影響

如前所述，MAPK信號途徑在細胞的生長過程中起著重要的調節作用。考慮到WDR26對該信號途徑潛在的抑制作用，我們希望知道它對于細胞生長是否也有一定的影響。我們分別建立了穩定轉染pCMV-WDR26的HeLa細胞系，并建立pCMV的穩定轉染HeLa細胞系作為對照。通過對這兩個細胞系進行生長計數并繪制出細胞生長曲線(圖3)，24h之后，穩定轉染pCMV-WDR26的HeLa細胞系的數目就已經達到對照組的兩倍，并且這樣的生長速度一直持續到120h之后。這一結果說明WDR26的過度表達加快了HeLa細胞的倍增速度，使其倍增時間有一定程度的縮短。進一步的流式細胞儀分析結果也表明過量表達WDR26蛋白使停留在分裂相的HeLa細胞數目增多(圖4)，這說明WDR26具有促進細胞分裂的作用。

綜上所述，我們初步認為WDR26蛋白對細胞的增殖有一定的促進作用。MAPK信號途徑對細胞增殖和凋亡的調節依賴于一個復雜的調控網絡。雖然多數研究結果表明該途徑的激活可以促進細胞生長，但對于細胞生存，MAPK具有正負兩方面的調控活性，例如Ras，ERK的激活因子被發現可以促進細胞凋亡，而WDR26蛋白——具有G_β的類似結構，以及對MAPK信號途徑潛在的負調控作用——能夠促進細胞分裂，加速細胞的增殖過程。那么，WDR26與MAPK信號途徑的關系，該蛋白與G_β在信號傳導調控中的相互關系都值得進一步地深入探討。

致謝：感謝湖南師范大學生命科學學院劉筠教授實驗室提供流式細胞儀!