輸卵管積水對(duì)窗口期子宮內(nèi)膜基因譜的影響

摘 要：應(yīng)用Affymetrix U133A 2.0基因表達(dá)譜芯片分析正常志愿者、輸卵管積水和輸卵管阻塞三者在胚泡植入窗期子宮內(nèi)膜基因的差異表達(dá)，正常樣本與積水樣本有顯著差異表達(dá)的基因588個(gè)，正常樣本與阻塞樣本180個(gè)，積水樣本與阻塞樣本750個(gè)，三者均有顯著差異表達(dá)的基因28個(gè)，該結(jié)果表明輸卵管積水患者的低妊娠率可能與其容受性受影響相關(guān)。

關(guān)鍵詞：子宮內(nèi)膜容受性；基因芯片；輸卵管積水；窗口期

中圖分類號(hào)：R711.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847(2007)04-0367-06

據(jù)WHO預(yù)測(cè)，21世紀(jì)不孕癥將成為僅次于腫瘤和心腦血管疾患的第三大疾病，輸卵管性疾病導(dǎo)致的不孕約占女性不孕癥的1/3，而其中輸卵管積水引起的不孕又占輸卵管性不孕的10％～30％，體外受精一胚胎移植(IVF-ET)在解決輸卵管病變引起的不孕癥中發(fā)揮了很大的作用，但是大量研究表明輸卵管性不孕患者接受IVF-ET治療的成功率偏低，特別是伴有輸卵管積水者成功率更低，這些表明輸卵管積水可能影響IVF-ET的成功率，本文應(yīng)用AffYmetrix U133A 2.0基因表達(dá)譜芯片分析正常志愿者、輸卵管阻塞不伴積水和輸卵管阻塞并積水三者在胚泡植入窗期子宮內(nèi)膜基因的差異表達(dá)，闡述輸卵管積水對(duì)子宮內(nèi)膜容受性影響的可能機(jī)制，為進(jìn)一步探討輸卵管積水對(duì)IVF-ET影響機(jī)制及如何提高妊娠率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本采集

我院生殖中心2005年收治的分別因雙側(cè)輸卵管阻塞伴積水和雙側(cè)輸卵管間質(zhì)部阻塞擬行IVF-ET的兩名患者及一名有生育史的健康志愿者，年齡分別為26、28和30歲，月經(jīng)規(guī)則、周期正常(28～32d)，B超檢查未發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征等疾病，在月經(jīng)周期的第10d開始使用尿LH試紙，測(cè)出LH峰，在LH峰值后的第7d(LH+7，著床窗口期)取出內(nèi)膜組織(3例組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí))，以生理鹽水漂洗樣本，于液氮中保存，正常樣本、積水樣本和阻塞樣本的編號(hào)分別為A、B、C，互為對(duì)照比較。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 寡核苷酸微陣列芯片

AffYmetrix U133A 2.0，代表了18400個(gè)轉(zhuǎn)錄本，包含了14 500個(gè)來自Unigene基因庫(kù)全長(zhǎng)人類基因。

1．2．2 樣品制備

用TRIzol法抽提3份樣品的總RNA，使用QIAGEN RNeasy試劑盒純化總RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定OD值及瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)控總RNA，以T7(d7)₂₄ Primer為引物，反轉(zhuǎn)錄完成cDNA第1條鏈的合成，以第1條鏈為模板進(jìn)行cDNA第2條鏈的合成，純化后的雙鏈cDNA，使用Genechip IVT Labeling Kit試劑盒直接進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，同時(shí)完成cRNA生物素標(biāo)記。再將純化并用分光光度計(jì)定量的體外轉(zhuǎn)錄后的cRNA產(chǎn)物經(jīng)高溫高鹽片段化為35～200bp。

1．2．3 芯片雜交及洗滌

將片段化的cRNA和其他試劑混合，配制雜交液，將雜交液注入芯片中，將3張芯片在雜交爐中雜交16h后取出芯片，用基因芯片洗滌工作站400洗脫和染色探針陣列。

1．2．4芯片掃描及結(jié)果分析

用基因芯片掃描儀3000掃描芯片，將芯片掃描結(jié)果用Affymetrix公司自帶的軟件GCOS1.2分析生物素?zé)晒庑盘?hào)的強(qiáng)度，3例樣本的掃描數(shù)據(jù)均統(tǒng)一到500，通過計(jì)算完全匹配的探針信號(hào)同堿基錯(cuò)配的探針信號(hào)之間的比值Ratio，采用系統(tǒng)的默認(rèn)值，來確定核酸雜交信號(hào)為存在(presentP)、邊界(marginal M)、不存在(absent A)，規(guī)定顯著差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為Signal Log Ratio(實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本比值取Log2后的值)≥2或≤-2，即Signal Log Ratio值≥2說明該基因在實(shí)驗(yàn)樣本較對(duì)照樣本表達(dá)顯著上調(diào)，Signal LogRatio值≤-2說明該基因在實(shí)驗(yàn)樣本較對(duì)照樣本表達(dá)顯著下調(diào)。

2 結(jié)果

2．1 總RNA抽提及cRNA片段化結(jié)果

從3例樣本中提取的總RNA OD260/OD280值均在1.8～2.1(見表1)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析RNA(見圖1)28S、18S條帶清晰，并且28S條帶的亮度和寬度為18S條帶的2倍，說明所提取的總RNA純度較高、完整性良好，樣品合格，符合芯片雜交的要求，cRNA片段化后為35~200 bp，均一性程度高，進(jìn)行基因芯片雜交條件好。

2．2 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

積水樣本與正常樣本相比，顯著表達(dá)差異的基因共588個(gè)，表達(dá)上調(diào)為351個(gè)，下調(diào)為237個(gè)，阻塞樣本與正常樣本相比，顯著性差異的基因共180個(gè)，表達(dá)上調(diào)為106個(gè)，下調(diào)為74個(gè)，積水樣本與阻塞樣本相比，顯著性差異的基因共750個(gè)，表達(dá)上調(diào)為302個(gè)，下調(diào)為448個(gè)，將積水樣本與正常樣本比較得到的數(shù)據(jù)和阻塞樣本與正常樣本比較得到的數(shù)據(jù)取交集，即在兩組數(shù)據(jù)中都出現(xiàn)2倍以上差異表達(dá)的基因共28個(gè)，表達(dá)均上調(diào)為7個(gè)，均下調(diào)為15個(gè)，兩組上下調(diào)方向不一致6個(gè)，這些差異基因的功能分類見表2和表3。

3 討論

基因芯片又稱DNA微陣列，是指采用原位合成或直接點(diǎn)樣的方法將大量DNA片段或寡核苷酸片段排列在硅片、玻璃等固體介質(zhì)上形成微矩陣，樣品核酸分子經(jīng)過標(biāo)記，與固定在載體上的DNA陣列中的各點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度而獲取樣品分子的基因信息，從而對(duì)基因序列及功能進(jìn)行研究，本課題進(jìn)行輸卵管積水、輸卵管阻塞及有生育史健康婦女窗口期子宮內(nèi)膜基因表達(dá)差異研究，以期篩查出輸卵管積水對(duì)子宮內(nèi)膜容受性影響的差異基因。

3．1 子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因

胚胎著床是從受精卵植入子宮內(nèi)膜開始的一系列細(xì)胞、分子信號(hào)傳遞過程，胚胎著床成功與否與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)，影響子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)因素較多，其分類尚無公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，本研究將篩選出子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因按功能分為以下幾類。

3．1．1 酶

S.Mirkin等分析分泌早期(LH+3)與分泌晚期(LH+7)的子宮內(nèi)膜：上調(diào)大于等于2倍的49個(gè)基因中，產(chǎn)物為酶的占11％；下調(diào)大于等于2倍的58個(gè)基因中，產(chǎn)物為酶的占25％，本研究顯示積水樣本與正常樣本、阻塞樣本與正常樣本及積水樣本與阻塞樣本相比差異基因中酶約占20％，這些酶有基質(zhì)金屬蛋白酶類、環(huán)氧合酶、脂氧合酶類、醛氧化酶、單胺氧化酶、谷胱甘肽過氧化酶，3(GPx-3)等。

3．1．2 細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架蛋白

S.MirkinEll等報(bào)道49個(gè)上調(diào)基因，產(chǎn)物發(fā)揮細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架蛋白功能的占19％；58個(gè)下調(diào)基因，發(fā)揮細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架蛋白功能的占11％，本研究顯示各樣本比較差異基因中產(chǎn)物發(fā)揮細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架蛋白功能的約占5％，結(jié)果差異較大是因?yàn)楦骰虍a(chǎn)物具有多重功能，分類有交叉重疊性，細(xì)胞黏附分子(CAMs)是一類參與細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附作用的糖蛋白，在著床過程中發(fā)揮重要作用，分為5大類：整合素、選擇素、鈣黏附分子、黏液素、免疫球蛋白超家族，其中研究較多的是整合素，細(xì)胞骨架蛋白是一類與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)，差異表達(dá)的有角蛋白、COMP、LOMD、OPN、肌動(dòng)蛋白等。

3．1．3 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、金屬離子結(jié)合蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白

S.Mirkin等報(bào)道49個(gè)上調(diào)基因，產(chǎn)物為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、離子結(jié)合蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白占38％，58個(gè)下調(diào)基因，為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、離子結(jié)合蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白占中占46％，本研究也顯示各樣本比較差異基因中產(chǎn)物為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子、離子結(jié)合蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的約占20％，產(chǎn)物為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的上調(diào)基因有生長(zhǎng)抑制和DNA損傷基因、絲裂原活化蛋白激酶等，差異表達(dá)的離子結(jié)合蛋白大多數(shù)是鈣離子結(jié)合蛋白，有膜連蛋白、金屬硫蛋白等，差異表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白有DKKl、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9、卷縮相關(guān)蛋白等。

3．1．4 免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白和載體蛋白

與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的差異基因?yàn)槊庖叻磻?yīng)相關(guān)蛋白有細(xì)胞分化抗原CD55、CD44、白介素、補(bǔ)體Clr、Cls等；載體蛋白有溶質(zhì)載體家族成員、PDZKl、SNXl0等。

3．1．5 其它

其它功能的蛋白有：細(xì)胞增殖、離子通道、分泌期蛋白、受體蛋白等，與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)且研究較多的有分泌期蛋白：胎盤蛋白-14。

3．2 輸卵管積水患者對(duì)子宮內(nèi)膜容受性影響的可能差異基因

目前采用Affymetrix公司芯片最完整的關(guān)于子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因的5份研究(Kao、Carson、Risesewijik、Brothwick、Mirkin)中共同認(rèn)定的植入窗期標(biāo)志性上調(diào)基因有骨橋蛋白、衰變加速因子、單胺氧化酶A、分裂激活蛋白激酶5、DNA誘導(dǎo)損傷抑生長(zhǎng)因子、補(bǔ)體1R亞單位、白介素-15、AnnexinⅣ、Apolipoprotein D、Dickkopfl、DNA結(jié)合抑制因子-4、Placetal protein-14、Adipsin、絲氨酸蛋白酶抑制因子、GTP-binding protein 2、Claudin 4、Nip 2；下調(diào)基因有：Olfactomedinrelated、ER Localized protein、Msh同源盒1、GATA結(jié)合蛋白2，在本研究中，輸卵管積水樣本中差異表達(dá)的植入窗期標(biāo)志性基因主要有以下幾種。

3．2．1 骨橋蛋白

骨橋蛋白(OPN或SPPI)是唯一一個(gè)在5份研究中一致上調(diào)的基因，本研究顯示積水樣本較正常樣本、阻塞樣本表達(dá)分別下調(diào)2.8、3，阻塞樣本與正常樣本無顯著差異，骨橋蛋白通過其分子中的精一甘，天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列一細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)域，識(shí)別細(xì)胞表面的受體整和素，與細(xì)胞結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷移和增殖分化等，其基因水平的增加促使分泌中期腔上皮細(xì)胞表面受體整合素α_v、β₃表達(dá)增加，因此OPN-α_vβ₃，復(fù)合體將會(huì)在種植窗內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞頂側(cè)緣形成，以促進(jìn)胚泡的著床，推測(cè)若其中一種表達(dá)減弱或兩者均減弱，導(dǎo)致該復(fù)合體不能有效的形成，將會(huì)影響胚泡的植入，另外，OPN還可以和CD44結(jié)合形成復(fù)合物覆蓋在于宮腔上皮的表面以募集淋巴細(xì)胞，從而使Th2型細(xì)胞因子增多，調(diào)節(jié)圍著床期子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的適應(yīng)性，以利胚胎成功地植入和維系妊娠。

3．2．2 胎盤蛋白-14

胎盤蛋白-14(placenta protein-14，PP-14，Glycodelin，PAEP)在3項(xiàng)研究中表達(dá)均上調(diào)，本研究中積水樣本較正常樣本、阻塞樣本表達(dá)分別下調(diào)6.1、6.6，阻塞樣本與正常樣本表達(dá)無顯著差異，PP-14最早是在胎盤中提取出來的，故命名為PP-14，但迄今尚無證據(jù)顯示胎盤能合成這種蛋白，故又將其更名為Glycodelin，不同組織Glycodelin的糖基化形式不同，其功能也不同，末端包被有唾液酸化的LacNAC或LandNAC天線的寡糖系列能特異性的阻斷細(xì)胞黏附及抑制由CD22(B細(xì)胞受體)介導(dǎo)的免疫活性，它們還能與凝集素樣受體結(jié)合，阻礙該受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞就是通過凝集素樣結(jié)合反應(yīng)來識(shí)別異種細(xì)胞，因此Glycodelin可以抑制這兩種細(xì)胞的免疫活性，由于E-選擇素的巖藻糖化抗原也在Glycodelin上表達(dá)，所以Glycodelin通過這種有巖藻糖化天線結(jié)構(gòu)的寡糖系列阻斷E，選擇素的連接位點(diǎn)而抑制細(xì)胞的黏附作用。Glycodelin對(duì)胚泡的成功植入及正常妊娠的維持有重要意義。

3．2．3 Dickkopfl

Dickkopfl(DKKl)在4項(xiàng)研究中表達(dá)均上調(diào)，本研究中積水樣本較正常樣本、阻塞樣本表達(dá)分別下調(diào)3.5、3.9。阻塞樣本與正常樣本表達(dá)無顯著差異，DKKl是一種分泌性糖蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜上的Wnt受體LRP5(或LRP6)和DKKl共受體Kremenl(或Kremen2)結(jié)合，形成內(nèi)吞小體，從而關(guān)閉Wnt信號(hào)通路，通過對(duì)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控決定細(xì)胞的分化、增殖、極性、遷移和癌變等特性，在腫瘤的發(fā)生和胚胎的發(fā)育方面發(fā)揮重要作用，DKKl在人類子宮內(nèi)膜分泌中期突發(fā)性地高表達(dá)，與著床窗的開啟在時(shí)間上一致，提示DKKl可能是介導(dǎo)胚胎著床的關(guān)鍵因子之一，文獻(xiàn)報(bào)道，DKKl在人胎盤中轉(zhuǎn)靈活性增強(qiáng)，蛋白表達(dá)豐富，提示DKKl在胎盤構(gòu)建，胚胎早期的分化發(fā)育中可能發(fā)揮一定的作用。

3．2．4 其它

衰變加速因子(DAF，CD55，)在4項(xiàng)研究中表達(dá)均上調(diào)，本研究中積水樣本較正常樣本、阻塞樣本表達(dá)分別下調(diào)4.8、4.2，阻塞樣本與正常樣本無顯著差異，DAF是一種重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，因能加速C3轉(zhuǎn)化酶的衰變而將其命名為衰變加速因子，在保護(hù)胎兒維持妊娠方面起重要作用。

單胺氧化酶A(MAOA)在4項(xiàng)研究中表達(dá)均上調(diào)，本研究中積水樣本較正常樣本、阻塞樣本表達(dá)分別下調(diào)3.8、3.6，阻塞樣本與正常樣本無顯著差異，人胎盤中MAOA活性較高，與去甲腎上腺素和腎上腺素的滅活有關(guān)，對(duì)維持妊娠起著重要作用。

DNA誘導(dǎo)損傷抑生長(zhǎng)因子(GADD45A)在4項(xiàng)研究中表達(dá)均上調(diào)，本研究中積水樣本較正常樣本、阻塞樣本表達(dá)分別下調(diào)3.2、3.4，阻塞樣本與正常樣本無顯著差異，GADD45基因可能在細(xì)胞周期控制、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中有重要作用。

DNA結(jié)合抑制因子-4(ID4)在3項(xiàng)研究中表達(dá)均上調(diào)，本研究中積水樣本較正常樣本、阻塞樣本表達(dá)分別下調(diào)2.5、2.4，阻塞樣本與正常樣本表達(dá)無顯著差異，ID4具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。

補(bǔ)體D(Adipsin，DF)在3項(xiàng)研究中表達(dá)均上調(diào)，本研究中積水樣本較正常樣本、阻塞樣本表達(dá)分別下調(diào)2.4、2.9，阻塞樣本與正常樣本表達(dá)無顯著差異，Adipsin由脂肪組織合成并分泌，是第一個(gè)從脂肪細(xì)胞系克隆的補(bǔ)體成分，在脂類代謝中起著重要作用。

嗅素相關(guān)蛋白-1(Olfactomedin related ERLocalized protein，OLFMl)在4項(xiàng)研究[2-5]中表達(dá)均下調(diào)。本研究中積水樣本較正常樣本表達(dá)上調(diào)2.3，積水樣本與阻塞樣本及阻塞樣本與正常樣本表達(dá)均無顯著差異，OLFMl產(chǎn)物為分泌期糖蛋白，與發(fā)育相關(guān)，參與多器官發(fā)育，特別是神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。

Msh同源盒1(MSXl)在3項(xiàng)研究中表達(dá)均下調(diào)，本研究中積水樣本較正常樣本表達(dá)上調(diào)2.8，積水樣本與阻塞樣本及阻塞樣本與正常樣本表達(dá)無顯著差異，Msx基因是同源基因盒(homeobox)基因家族的成員，即Hoxa 7，表達(dá)于上皮組織中，其表達(dá)水平與上皮細(xì)胞的增生能力有關(guān)，下調(diào)該基因表達(dá)水平可以使基底細(xì)胞增殖能力下降。

大部分共同認(rèn)定的植入窗期標(biāo)志性基因在積水樣本與正常樣本、阻塞樣本表達(dá)均有差異，且改變方向相反，說明輸卵管積水患者子宮內(nèi)膜容受性受到影響，可能導(dǎo)致其IVF時(shí)低妊娠率，但限于樣本含量較小、研究對(duì)象個(gè)體差異、取材時(shí)間差異、使用基因芯片種類不同、結(jié)果分析軟件不同及隨機(jī)誤差等造成基因芯片在子宮內(nèi)膜容受性研究方面重復(fù)性、可比性差，子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因研究結(jié)果不一致，其重復(fù)性、再現(xiàn)陸和可比性還有待進(jìn)一步提高。此外，基因芯片技術(shù)篩查出的差異基因尚需進(jìn)一步的生物學(xué)分析和機(jī)制研究。但是，隨著基因芯片技術(shù)的不斷成熟，很多問題能被逐漸解決，基因芯片技術(shù)作為一個(gè)技術(shù)平臺(tái)必然給眾多不孕癥患者帶來新的希望。

作者簡(jiǎn)介：李艷萍(1962—)，女，湖南長(zhǎng)沙人，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院教授，博士，通訊作者，主要從事輔助生殖臨床工作及研究；趙紅翠(1984—)，女，安徽銅陵人，碩士研究生，主要從事輔助生殖研究。