ＲＮＡｉ抑制肝星狀細胞ＴＩＭＰ－Ｉ基因表達及對細胞生物學(xué)行為的影響

摘 要：研究了siRNA對大鼠肝星狀細胞(CFSC)TIMP-I基因表達及對細胞生物學(xué)行為的影響，用RT-PCR方法獲得帶有T7啟動子的TIMP-I全基因序列，體外轉(zhuǎn)錄法獲得TIMP-1dsRNA，Diccr酶切后得到siRNA，用質(zhì)脂體將siRNA轉(zhuǎn)染至CFSC，RT-PCR檢測TIMP-I mRNA的表達，MTT方法檢測細胞生長，流式細胞儀檢測細胞凋亡，結(jié)果成功獲得TIMP-I siRNA，將TIMP-I siRNA轉(zhuǎn)染至CP5C 12、24、48 h后，與對照相比，TIMP-I mRNA的表達逐漸下降，經(jīng)OuanitY Onc(BIO-RAD，USA)分析后，其抑制率分別為49.18％、58.72％和64.73％；siRNA轉(zhuǎn)染CFSC細胞后，CFSC生長受到抑制，細胞凋亡不明顯，實驗結(jié)果表明體外轉(zhuǎn)錄法得到的siRNA能有效地降低大鼠CFSC中TIMP-I的表達，明顯抑制CFSC的增殖，但不直接引起CFSC的凋亡。

關(guān)鍵詞：RNAi；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1；肝星狀細胞；細胞凋亡

中圖分類號：R34 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0342-06

基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子－1(TIMP-1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種由巨噬細胞和結(jié)締組織細胞產(chǎn)生，可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性的糖蛋白，其分子質(zhì)量為20kD，由207個氨基酸組成，TIMP-1廣泛存在于組織和體液中，但在正常肝組織中卻很少表達，在發(fā)生肝纖維化時，肝組織中TIMP-I基因表達水平隨著肝纖維化程度的加重而增加，當肝纖維化的逆轉(zhuǎn)時其表達水平下降，可見了IMP-1對肝纖維化的維持起著重要的作用，目前抑制TIMP-I基因在肝纖維化組織中的表達已經(jīng)成為抗肝纖維化研究熱點之一，本研究采用RNAi技術(shù)，抑制了大鼠肝星狀細胞中TIMP-I基因表達，并探討TIMP-I基因表達受到抑制后對CFSC的增殖與凋亡影響，為肝纖維化的治療提供新的治療手段。

1 材料與方法

1．1 主要材料

1．1．1 載體、細胞和菌株 pGEM-T載體購自Promega公司，肝星狀細胞系(CFSC)由上海長征醫(yī)院饋贈，E.coli JMl09購自TaKaRa公司。

1．1．2 主要試劑

RT-PCR kit、Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品 ;RNAMaxx high yield transcription kit，Recombi-nant Dicer Enzyme kit，GeneEraser siRNA Transfe-ction Reagent kit均為Stratagene公司產(chǎn)品；AnnexinV，F(xiàn)ITC細胞凋亡檢測試劑盒為北京寶賽公司產(chǎn)品、四甲基偶氮唑(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 總RNA的提取及RT-PCR法獲得TIMP-I目的基因

從-80℃冰箱中取8周大鼠冰凍肝組織(用本室已構(gòu)建的大鼠肝纖維化模型)100mg，放入勻漿器中，按說明書用Trizol試劑提取總RNA，-20℃保存，Primer premier 5.0引物設(shè)計軟件自行設(shè)計并由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成兩對PCR引物，序列如下(劃線處為T7啟動子部分)：

第一對引物

Sense primer: 5'-CTFCCAGTAAAGCCTGTGG-3'Antisense primer: 5'-GGGAAGGCTI'CGGGTCAT-3'

第二對引物

Sense prime: 5'GCGTAATACGACTCACTATAGGC

TTCCAGTAAAGCCTGTAG-3'

Antisense primer: 5'-GCGTAATACGACTCACTATA

GGGGGAAGGCTTCGGGTCAT-3'

參照Invitrogen二步法RT-PCR試劑盒說明書，以1μg總RNA為模板進行RT-PCR，循環(huán)參數(shù)為94℃2min，94℃30s，48℃30s，72℃50s，30個循環(huán)，72℃5 min。

1．2．2 pGEM-T/TIMP-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

TIMP-I基因的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳回收，在4℃下與pGEM-T載體過夜連接，取10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JMl09感受態(tài)細胞，把轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐青霉素和IPTG與X-gal的平板上，放置于37℃孵箱中過夜培養(yǎng)，挑選白色單個菌落，經(jīng)含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)孵育12h后，取質(zhì)粒DNA，進行PCR并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送上海博亞公司測序。

1．2．3 PCR法獲得帶有T7啟動子的TIMP-I目的片段

用帶有T7啟動子的引物，以重組質(zhì)粒pGEM-T/TIMP-I為模板，進行PCR擴增，循環(huán)參數(shù)為：94℃ 2min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃45s，25個循環(huán)，72℃5min。

1．2．4 體外轉(zhuǎn)錄法獲得TIMP-IdsRNA

按Stratagene’s RNAMaxx high yield transcrip-tion kit提供方法進行轉(zhuǎn)錄，加入25μL無菌DEPC-H₂和25μL LiCl沉淀試劑到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，并快速渦旋；-20℃冷凍30min后，4℃、1000g離心15min；小心棄上清，加入1mL乙醇清洗沉淀，室溫、12000g離心10min；棄上清，讓沉淀在空氣中干燥，用DEPC-H₂O重溶dsRNA；最后采用甲醛變性電泳檢驗反應(yīng)產(chǎn)物，

1．2．5 Dicer酶切TIMP-I dsRNA獲得TIMP-I siRNA

采用Stratagene公司的Recombinant DicerEnzyme kit提供的方法操作，將2μL 5×Dicerreaction buffer、2μL Recombinant Dicer enzyme(0.5U/μL)、1μL dsRNA(1μg)、5μL Distilledwater混合樣品后，37℃溫育19h。

1．2．6 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

采用Stratagene公司GeneEraser siRNATransfection Reagent kit提供的方法操作，轉(zhuǎn)染前24h，鋪CFSC至6孔板，細胞數(shù)為每孔2×10⁴/個，待細胞密度達40％～70％時進行轉(zhuǎn)染，將200μL無血清、無抗生素培養(yǎng)基和6μL轉(zhuǎn)染試劑加入到離心管中，渦旋混合后，室溫溫育10min；再加入10μL siRNA到上述稀釋的轉(zhuǎn)染試劑中，輕彈混勻后，室溫孵育10min；棄培養(yǎng)基，向6孔板中加入2 mL完全培養(yǎng)基；將轉(zhuǎn)染混合液滴到細胞上，輕輕搖晃孔板，放于CO₂孵箱中培養(yǎng)，并分別于12、24、48 h后進行檢測。

1．2．7 RT-PCR檢測TIMP-I基因表達

去除轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)液，加入1mL Trizol試劑，提取總RNA，RT-PCR擴增目的基因，具體方法同前。

1．2．8 MTT法檢測CFSC增殖

CFSC細胞按每孔1×10⁴個接種于96孔板，于37℃、CO₂條件下培養(yǎng)24h，每組設(shè)6個復(fù)孔，分組為：①空白細胞對照組；②轉(zhuǎn)染試劑對照組；③siRNA轉(zhuǎn)染組，操作按試劑書說明進行，每孔加脂質(zhì)體1μL，其中第③組加入TIMP-I siRNA lμg比例，以轉(zhuǎn)染結(jié)束的時間點定為0h，各組繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，分別于12、24、48 h終止培養(yǎng)，每孔中加MTT 20μL(10g/L)，同樣條件下保溫4h，棄上清，每孔加入200μL二甲基亞礬(DM-SO)，混勻，在酶標儀上測定波長570nm處吸光度(A)值，計算各時間點CFSC的存活抑制率，實驗重復(fù)2次。

1．2．9 流式細胞儀檢測細胞調(diào)亡

參照AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書，把轉(zhuǎn)染后的細胞制成單細胞懸液并固定，并用流式細胞儀進行檢測。

2 結(jié)果

2．1 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

從圖l中可以看出所擴增的片段在500～700bp之間，與目的條帶的長度578 bp一致，

2．2 pGEM-T/TIMP-I重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

pGEM-T/TIMP-T重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后，所得片段與RT-PCR相符，經(jīng)測序，所獲得的目的基因與GenBank報道結(jié)果完全一致，說明成功構(gòu)建pGEM-T/TIMP-1重組質(zhì)粒，為進一步獲得TIMP-I的dsRNA奠定了基礎(chǔ)(見圖2)。

2．3 帶有T7啟動子的目的基因的獲得及結(jié)果

以重組質(zhì)粒pGEM-T/TIMP-I為模板，進行PCR擴增帶有獲得T7啟動子的目的基因，從圖3中可見600bp處有一條清晰目的基因條帶，與目的條帶的長度618bp一致。

2．4 甲醛變性電泳檢測結(jié)果

將體外轉(zhuǎn)錄法獲得的TIMP-I的dsRNA進行甲醛變性電泳，由圖4可見瓊脂糖凝膠中顯示清晰的目的基因條帶。

2．5 TIMP-I siRNA轉(zhuǎn)染CFSC后RT-PCR檢測TIMP-1 mRNA的表達

從圖5可以看出經(jīng)體外Dicer酶切得到的siRNA轉(zhuǎn)染CFSC 12、24、48 h后TIMP-I mRNA的表達逐漸下降，經(jīng)Quality One(BIO-RAD，USA)分析后，其抑制率為49.18％、58.72％和64.73％。

2．6 MTT法檢測細胞增殖結(jié)果

如(表1)所示，實驗組48h的OD值高于細胞對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05，根據(jù)OD值繪制的生長曲線表明，TIMP-I siRNA轉(zhuǎn)染CFSC后48h，可檢測到細胞增殖降低(圖6)。

2．7 流式細胞儀檢測細胞調(diào)亡結(jié)果

如圖7所示，流式細胞儀檢測結(jié)果中右下象限為細胞早期調(diào)亡的數(shù)量，從圖7中可以看出轉(zhuǎn)染siRNA后的CFSC早期凋亡的數(shù)量在12，24，48h與對照組細胞相比較，無明顯差異。

3 討論

3．1 TIMP-1在肝纖維化中的作用

肝纖維化的發(fā)生是由于多種因素的相互作用，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(ECM)在肝內(nèi)大量堆積，原因之一是組織內(nèi)金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)活性降低，從而阻止了ECM的降解，使ECM正常轉(zhuǎn)換發(fā)生障礙，肝臟受損后，一方面ECM合成增多，另一方面金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)表達上調(diào)，發(fā)揮對MMPs的普遍抑制作用，使ECM降解減少，沉積增多，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成，肝纖維化與肝星狀細胞的活化也存在密切的關(guān)系，肝纖維化時肝星狀細胞發(fā)生表現(xiàn)型的改變，稱為“活化”，肝臟肝星狀細胞活化伴隨著一系列的功能改變，主要包括合成大量細胞外基質(zhì)、細胞增殖明顯、分泌趨化性因子及細胞因子、細胞外基質(zhì)降解酶合成異常等，這些功能的改變決定了其在肝纖維化形成中的關(guān)鍵作用，TIMP-I是肝纖維化發(fā)生過程中的關(guān)鍵分子，它在肝組織中持續(xù)表達的增高可能是維持肝星狀細胞活化或抑制其凋亡的關(guān)鍵因素，而設(shè)法降低TIMP-I在活化的肝星形細胞中的表達已成為抗肝纖維化的研究熱點之一，目前，反義核酸技術(shù)等基因阻斷技術(shù)已應(yīng)用到肝纖維化的基因治療中，但效果不十分理想。

3．2 RNA干擾技術(shù)的選擇

RNA干擾是新的基因阻斷技術(shù)，是由雙鏈siRNA介導(dǎo)的、在轉(zhuǎn)錄后mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)基因的表達，是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，具有高效、特異、簡單等特點，目前獲得siRNA的方法主要有：體外轉(zhuǎn)錄法、化學(xué)合成法、載體表達法等，本研究采用體外轉(zhuǎn)錄法獲得siRNA，該方法與其他方法相比較，可大量、快速制備目的siRNA，并能省去大量的篩選工作。

3．3 TIMP-1與肝星狀細胞增殖及凋亡的關(guān)系

由于活化的肝星狀細胞具有增殖明顯的特征，其數(shù)量的增多，也會導(dǎo)致ECM的增加而造成肝纖維化，因此，抑制活化的肝星狀細胞的增殖，對肝纖維化的治療也具有重要意義，本研究用TIMP-I siRNA轉(zhuǎn)染CFSC后通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)細胞生長受到抑制，表明沉默TIMP-1的基因表達能夠抑制細胞的增殖。活化的肝星狀細胞的凋亡是一個非常復(fù)雜的過程，涉及多種因素及細胞因子的相互作用，肝星狀細胞活力維持，與這些因子的作用有密切關(guān)系，本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)將TIMP-1 siRNA轉(zhuǎn)染肝星狀細胞12、24、48h后，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)細胞的時間增加TIMP-1mRNA表達逐漸降低，同時用流式細胞儀檢測早期凋亡的結(jié)果顯示細胞凋亡數(shù)量不明顯，分析的原因可能為參與到肝星狀細胞的激活、轉(zhuǎn)化及調(diào)節(jié)的細胞因子可多達幾十種，因此，體外培養(yǎng)的肝星狀細胞中單獨降低了TIMP-I的表達可能不一定會直接引起其凋亡。

作者簡介：徐華鋒(1971—)，男，黑龍江哈爾濱人，博士研究生，講師，主要從事生物大分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究；于曉光(1963—)，女，黑龍江哈爾濱人，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，通訊作者，主要從事生物大分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究。