擬南芥芥子酶基因ＴＧＧ６是花特異表達(dá)的假基因

摘 要：芥子酶是一類催化硫代葡萄糖苷水解的同工酶，TGG6是在擬南芥中新發(fā)現(xiàn)的芥子酶基因，從擬南芥幾個(gè)不同生態(tài)型中克隆了TGG6基因的全長核基因和cDNA片段，序列分析結(jié)果表明，所有供試的生態(tài)型的TGG6基因都與擬南芥第3個(gè)芥子酶基因TcC3類似，在編碼區(qū)存在1個(gè)以上移碼突變，不能編碼完整多肽。生態(tài)型Col-O第10個(gè)內(nèi)含子的剪切邊界還發(fā)生了缺失，導(dǎo)致內(nèi)含子不能被切除，初步確定TGG6是一個(gè)假基因，然而，RT-PCR結(jié)果卻表明TGG6在花器中特異性表達(dá)，說明TGG6在進(jìn)化的某個(gè)階段可能是有功能的基因，由于某種原因，該基因在進(jìn)化過程中被失活。

關(guān)鍵詞：擬南芥：芥子酶；TGG6；組織特異表達(dá)；花特異表達(dá)；假基因

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0316-07

隨著更多物種基因組測序計(jì)劃的展開或完成，人們對假基因的概念及其意義有了更新的思考，并成為基因組學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，假基因(pseUdogene)被定義為核苷酸序列與相應(yīng)正常功能基因相似的，但不能合成功能蛋白質(zhì)的失活基因，假基因最初由jacq等人提出。他們在非洲爪蟾DNA中克隆了一個(gè)5S rRNA相關(guān)基因，在與其相應(yīng)功能基因比較后發(fā)現(xiàn)，這個(gè)基因的5′端有16bp的缺失以及14bp的錯(cuò)配，不具有正常5S rRNA的功能，因此，將這個(gè)截短的5SrRNA的相關(guān)基因描述為假基因，隨著人類基因組計(jì)劃的完成和后基因組計(jì)劃的實(shí)施，對占人類基因組約90％的非編碼序列的研究已經(jīng)展開，預(yù)計(jì)人類基因組中有約20000種假基因，在線蟲、果蠅以及酵母等生物中也發(fā)現(xiàn)大量假基因，假基因保留了祖先功能基因的殘余拷貝，為研究生物進(jìn)化和基因組動(dòng)態(tài)變化，分析基因復(fù)制與突變等事件的年代以及頻率，揭示基因組DNA替換、插入和缺失等事件的機(jī)制提供了重要線索，此外測定假基因的分布可為新基因的預(yù)測以及鑒定提供更好的幫助。

芥子酶(myrosinase，EC3.2.1.147)是一類硫代葡糖苷酶，主要分布在白花菜目植物中，專一降解硫代葡糖苷，芥子酶和硫代葡糖苷分別儲(chǔ)藏在不同的細(xì)胞中，當(dāng)植物受到昆蟲或病源傷害時(shí)，芥子酶將硫代葡萄糖苷水解為異硫氰化合物、硫氰化合物、腈或(口惡)唑烷硫酮等有毒物質(zhì)，抵御病蟲侵襲，因此認(rèn)為“芥子酶／硫代葡萄糖苷”系統(tǒng)是植物重要的防御系統(tǒng)，目前已在15個(gè)科500多種雙子葉植物中檢測到芥子酶活性，其中，對十字花科作物的芥子酶研究得較多，油菜和白芥等作物的芥子酶基因家族由MA、MB、MC 3個(gè)亞家族組成，共20多個(gè)基因，其中部分基因已被證實(shí)為假基因”。

在擬南芥中，最初認(rèn)為只有3個(gè)芥子酶基因，其中第3個(gè)基因TGG3被證實(shí)為花特異表達(dá)的假基因，由于3個(gè)基因都不在根中表達(dá)，人們卻檢測到根提取物的芥子酶活性，因此推測存在更多的芥子酶基因，2001年Nitz等分離到一個(gè)根特異表達(dá)的葡萄糖苷酶基因Pyk10，由于與芥子酶基因相似性高，認(rèn)為是芥子酶基因，但是由于沒有酶活性測定證據(jù)，而且Pyk10不具備芥子酶關(guān)鍵特征位點(diǎn)，因此Pyk10不一定是芥子酶基因，通過Blast分析，我們發(fā)現(xiàn)了3個(gè)序列高度相似的基因具有芥子酶基因的特征，分別命名為TGG4、TGG5、TGG6，其中TGG4、TGG5在根部特異表達(dá)，酵母表達(dá)產(chǎn)物具有芥子酶活性，證明是芥子酶基因(待發(fā)表)，TGG6在DNA序列上與TGG4和TGG5高度相似，但是在根部檢測不到表達(dá)。使用TGG4和TGG5的cDNA序列與GenBank中的TGG6基因組DNA序列比對，個(gè)別內(nèi)含子的剪切邊界很難確定，因此難以斷定TGG6是否是有功能的基因，本研究同時(shí)從擬南芥幾個(gè)生態(tài)型克隆了TGG6的核基因和cDNA，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)TGG6存在移碼突變和內(nèi)含子剪切邊界的突變，不能合成有功能的芥子酶，具有假基因的特征，因此推測TGG6是一個(gè)假基因。

1 材料與方法

1．1 擬南芥生態(tài)型和種植方法

本實(shí)驗(yàn)所使用的生態(tài)型Col-O、Ba-O、Ws-O來自Nottingham Arabidopsis Stock Center，England，JM1、JM2由作者實(shí)驗(yàn)室收集保存，種子播種在標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)土上，4℃放置3d后轉(zhuǎn)到培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度20℃，光照16h/d，光照強(qiáng)度5000lx，

1．2 總DNA的提取和，GG6基因的克隆

取擬南芥5種生態(tài)型植株的葉片，液氮研磨，采用大連寶生物公司總DNA提取試劑盒提取總DNA，以基因特異引物G6F1(5′-ACCCGCTGAAAAGCTCCATCAA-3′)，G6R1(5′-GGCTYCCACTYATITYGCAATGAACC-3′)擴(kuò)增TGG6基因組DNA，引物由上海閃晶生物公司合成，DNA聚合酶LATaq來自大連寶生物公司，PCR產(chǎn)物克隆在pMD-19T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α，酶切鑒定后，由上海閃晶生物公司測序，每個(gè)生態(tài)型TGG6基因至少測3個(gè)克隆，以排除PCR錯(cuò)誤對序列的影響。

1．3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

分別取新鮮的擬南芥根、莖、葉、花、子葉和綠色角果約50mg，液氮迅速研磨，加入500μLTrizol試劑，劇烈震蕩，按照上海申能博彩公司的3S Trizol T0tal RNA Isolation Kit試劑盒說明書進(jìn)行提取，電泳檢測各樣品的總RNA質(zhì)量和濃度，以5μL RNA為模板，合成第一鏈cDNA，按照上海生工AMV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書的方法進(jìn)行，eDNA的合成過體系如下：在一個(gè)Eppendorf管中，加入各個(gè)組織的總RNA 5μL，oligo(dT)lμL，RNase-Free H₂O 6μL，輕彈混勻離心后置于70℃變性5min，立即取出放置冰上30s，然后加入以下試劑：緩沖液4μL，dNTP 2μL，RNase inhibitor 1μL，輕彈混勻離心后37℃反應(yīng)5min，再加入AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μL，37℃水浴1h，70℃/10min終止反應(yīng)。

1．4 TGG6基因在擬南芥各器官組織中的表達(dá)分析

以上述第一鏈cDNA為模板，用半定量PCR方法擴(kuò)增TGG6 cDNA，在基因轉(zhuǎn)錄水平探討JPTGG6基因在擬南芥植株中的表達(dá)情況，PCR反應(yīng)體系(50μL)：擬南芥cDNA 100ng(1.5μL)，dNTP 4μL，10×PCR buffer 5μL，上游、下游引物G6F1、G6R1各1姓，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O 37μL，反應(yīng)條件如下：95℃，2min；94℃，30s，56.3℃，45s，72℃，1min 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃，7min結(jié)束反應(yīng)，以Actl基因的表達(dá)作為參照，Actin基因的引物序列為：5′-GGCAAAAGGATGCTFATGTTGG-3′，5′-ATITCACGCTCTGCTGTGGTGG-3′，反應(yīng)結(jié)束后取5μL進(jìn)行電泳檢測，照相。

PCR陽性的產(chǎn)物純化后，連接至pMD-19T載體，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆，酶切鑒定后送上海閃晶生物公司進(jìn)行序列測定。

2 結(jié)果與分析

2．1 生態(tài)型Col-O的TGG6基因的失活突變

植物芥子酶基因一般都由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成，TGG4和JP7GG5代表一個(gè)芥子酶基因新家族，其基因由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成(待發(fā)表)，TGG6基因序列與TGG4和TGG5相似型較高，基因結(jié)構(gòu)也相似，由13個(gè)外顯子組成，不過，將生態(tài)型Col-O的TGG6核基因序列、cDNA序列與TGG4、TGG5基因序列比較發(fā)現(xiàn)，在TGG6中存在4個(gè)移碼突變，包括第1個(gè)外顯子中2個(gè)堿基的插入突變、第6個(gè)外顯子中1個(gè)堿基的插入突變、第9個(gè)外顯子中4個(gè)堿基的缺失突變以及第12個(gè)外顯子中17個(gè)堿基的缺失突變(圖1)，這些突變都使TGG6基因不能編碼正確的芥子酶，此外，Col-0的TGG6基因的第10個(gè)內(nèi)含子的3’端剪切邊界區(qū)域發(fā)生9個(gè)堿基的缺失突變(與TGG4比較)，導(dǎo)致第10個(gè)內(nèi)含子保留在cDNA中，未被剪切。有趣的是，TGG6第10個(gè)內(nèi)含子的5′端的剪切邊界與JP7GG4和JPTGG5-樣，是一個(gè)異常邊界“GC”。

2．2 TGG6在花中特異表達(dá)

以擬南芥生態(tài)型Col-O為材料，從不同器官中提取總RNA，結(jié)果如圖2所示，由圖2可以看出RNA條帶整齊，完整性良好，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

說明第6個(gè)外顯子的插入突變是TGG6基因最早發(fā)生的基因失活突變，它發(fā)生在擬南芥生態(tài)型分化之前，而其它位點(diǎn)的突變發(fā)生在JMl、JM2與Col-0等生態(tài)型的分化之后。

RT-PCR結(jié)果(圖3)表明，TGG6基因在花中特異表達(dá)，在子葉、根、莖、葉和角果中都檢測不到表達(dá)。

2．3 不同生態(tài)型TGG6基因的克隆及多態(tài)性分析 分別從Col-O、JMl、JM2、Ws-O、Ba-O等擬南芥生態(tài)型克隆TGG6基因組DNA和cDNA，測序后進(jìn)行序列比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生態(tài)型Ws-O和Ba-O與Col-O序列相似性接近100％，具有Col-O的所有移碼突變以及第10個(gè)內(nèi)含子的剪切邊界缺失，但生態(tài)型JMl和JM2僅具有第6個(gè)外顯子的1個(gè)堿基的插入突變，其它突變位點(diǎn)都正常(表1)。

3 討論

在過去的幾十年中，假基因一直被認(rèn)為是分子化石，是進(jìn)化中基因突變的遺跡，沒有功能，屬于“垃圾基因”，與相應(yīng)的正常基因相比較，假基因缺少正常基因的內(nèi)含子，兩側(cè)有順向重復(fù)序列等，大多數(shù)假基因本身存在著多種遺傳缺陷，例如早熟終止密碼以及移碼突變等等，因而它們的表達(dá)受到了抑制，但是近來科學(xué)家發(fā)現(xiàn)假基因并不是“垃圾基因”，假基因在基因表達(dá)、調(diào)控以及產(chǎn)生基因多樣性等方面可能都扮演著極為重要的角色，但到目前為止，其確切的作用機(jī)制仍不清楚。

目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)6個(gè)芥子酶基因即TGG1、TGG2、TGG3、TGG4、TGG5及TGG6(TGG4、TGG5及TGG6未發(fā)表)，其中TGG1、TGG2、TGG4、TGG5已被證實(shí)是有功能的基因，TGG3是不能編碼完整芥子酶的假基因，本研究通過對5個(gè)擬南芥生態(tài)型TGG6基因的序列、結(jié)構(gòu)和表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)TGG6基因在所有5個(gè)生態(tài)型中都存在第6個(gè)外顯子的插入型移碼突變，導(dǎo)致基因不能編碼完整的芥子酶，因此認(rèn)為TGG6與TGG3一樣，是一個(gè)假基因，由于TGG6在基因序列中存在TGG4和TGG5中的所有內(nèi)含子，TGG6是在基因重復(fù)發(fā)生后，再通過失活突變而形成的，然而，與TGG3一樣，TGG6也在花中特異表達(dá)，而且TGG6在所有生態(tài)型中所共有的移碼突變發(fā)生在第6個(gè)外顯子，與TGG3在所有生態(tài)型中所共有的移碼突變(第5個(gè)外顯子)的位置非常接近(圖4)，這種現(xiàn)象到底是必然還是巧合有待進(jìn)一步研究。

TGGI3由12個(gè)外顯子組成，TGG4-6由13個(gè)外顯子組成，其差別來自在TGGl—3中的第5個(gè)外顯子在TGG4-6中被1個(gè)內(nèi)含子分割為兩個(gè)外顯子，TGG6和TGG3的表達(dá)特征與TGGl和TGG2在葉片、子葉、莖、花和角果中表達(dá)，TGG4與TGG5在根部表達(dá)形成鮮明的對比，這些信息暗示TGG6和TGG3可能還有某種未知的功能，另外，由于TGG6和TGG3的突變發(fā)生在基因重復(fù)之后，在進(jìn)化的歷史上是否還殘留著功能基因，并保存在某個(gè)地區(qū)的某種生態(tài)型中?TGG6和TGG3為什么要發(fā)生突變?突變被自然選擇所保留的生物學(xué)意義是什么?這都是今后研究必須回答的問題。

作者簡介：汪萌(1981—)，女，山東聊城人，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究；張家明(1966—)，男，湖北公安人，熱帶生物技術(shù)研究所研究員，博士生導(dǎo)師，通訊作者，主要從事作物遺傳育種和分子生物學(xué)研究。