弓１蟲ＲＨ株ＳＡＧ１基因序列體外擴增及生物信息學(xué)分析

摘 要：根據(jù)SAG1基因序列，自行設(shè)計一對寡核苷酸引物。利用PCR技術(shù)從弓形蟲RH株基因組DNA中成功擴增出編碼SAG1抗原的基因片段，擴增出的基因片段大小與預(yù)期長度(1006bp)相符，結(jié)果經(jīng)測序驗證，并利用生物信息學(xué)方法對SAG1蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能進行了預(yù)測。

關(guān)鍵詞：弓形蟲；SAC1基因；體外擴增；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：R382.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0348-04

弓形蟲(Toxop1asma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可感染包括人類在內(nèi)的所有哺乳動物的有核細(xì)胞，正常人感染弓形蟲后，多呈無癥狀帶蟲免疫狀態(tài)，但孕婦感染后，則可致流產(chǎn)、死胎以及胎兒先天畸形，弓形蟲作為一種重要的機會性致病原蟲，已成為導(dǎo)致免疫缺陷患者死亡的主要原因之一，sAC1是剛地弓形蟲速殖子主要表面抗原之一，其分子質(zhì)量約為30kD，研究表明3AC1在弓形蟲入侵宿主的過程中發(fā)揮了雙重作用，它不僅在介導(dǎo)弓形蟲速殖子入侵宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮了重要作用，而且還可引發(fā)宿主體內(nèi)強烈的抗原抗體反應(yīng)，此種免疫原性特質(zhì)，使其成為診斷性抗原與免疫性抗原的重要候選基因，本文根據(jù)RH株54C1基因序列參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計并合成了一對寡核苷酸引物，采用PCR技術(shù)從弓形蟲RH株基因組DNA中擴增編碼SAC1基因片段，并對其進行序列測定及生物信息學(xué)分析，為進一步通過基因工程進行表達(dá)做準(zhǔn)備，同時也為體外研究弓形蟲SAC1基因的結(jié)構(gòu)與功能及其在免疫診斷學(xué)中的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑及工具酶

TaqDNA聚合酶(Takara公司)；dNTPs、蛋白酶K(上海生物工程公司)；Tris堿、SDS、EDTA、酚、氯仿均為國產(chǎn)分析純。

1．1．2 蟲株

弓形蟲RH株由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳觀今教授惠贈。

1．1．3 實驗動物

SPF級昆明小鼠，6～8周齡，18～20g，購于廣東醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1．2 方法

1．2．1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中弓形蟲54C1基因序列(序列號：S76248)311～1321位，設(shè)計一對引物P1和P2，P1：5'-ATGTCGGTTTCGCTGCACCACTT-3，，P2:5-TACGCGACACAAGCTGCGATAGAGCC-3'，引物由上海生工合成，并經(jīng)PAGE純化。

1．2．2 弓形蟲基因組DNA提取

弓形蟲RH株速殖子復(fù)蘇后，每只0.3m1腹腔接種感染昆明小鼠，3～5d后，脫頸處死小鼠，腹腔注入2m1 PBS，收集腹水，PBS洗滌兩次，離心收集蟲體，加100mmo1/1Tris-C1，5 mmo1/1EDTA，200 mmo1/1 NaC1，1％SDS，100mg/1蛋白酶K，55℃震蕩過夜，然后分別用飽和酚、氯仿／異戊醇各抽提一次，等體積異丙醇沉淀，沉淀溶于100μ1三蒸水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 目的基因片段的PCR擴增

在0.2m1 Eppendoff管中依次加入下列成份：ddH₂O 36.75μ1 10x緩沖液5μ1、dNTP(10mmo1/1)1μ1、正反向引物(20μmo1/1)各1μ1、模版DNA 5μ1，Taq酶0.25μ1，總反應(yīng)體積為50μ1.95℃預(yù)熱10min后，94℃60s，50℃60s，72℃ 120s，行30個循環(huán)，將PCR產(chǎn)物5tx1在含溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠中電泳，UVP觀察結(jié)果并拍照。

1．2．4 DNA序列測定

PCR產(chǎn)物由上海英駿生物技術(shù)公司進行序列測定。并與GenBank中的基因序列(S76248)進行同源性比對。

1．2．5 克隆序列的生物信息學(xué)分析方法

利用ExPASy中的Trans1ate程序?qū)AC1基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，通過protparam(http://us.expasy.org/egi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化參數(shù)，采用NCBI服務(wù)器中的CDD程序?qū)Π被嵝蛄羞M行保守功能域分析，判斷該基因是否具有完整的保守結(jié)構(gòu)域，進一步推斷對應(yīng)的核苷酸序列是否具有完整的開放讀碼框，采用InterPro程序(http://www.ebi.ac.uk/InterProSean)對SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫進行檢索，尋找氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域，了解目的序列可能的功能性質(zhì)，利用NPS及Singa1 IP3.0及PSORT服務(wù)器，對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及折疊類型、信號肽位置、亞細(xì)胞定位及跨膜螺旋域進行預(yù)測，進一步了解目的序列的基本特征。

2 結(jié)果

2．1 目的基因擴增

從弓形蟲RH株基因組DNA中特異擴增出編碼SAG1表面抗原基因片段，PCR產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，

2．2 SAG1基因序列測定

以PCR擴增的特異引物，從正反兩個方向進行測序，雙向測序的結(jié)果相吻合，與GenBank中所給的基因序列(S76248)相比對，所擴增序列位于sAC1基因組DNA序列的311～1321處，共1006個堿基，包含了SAC1基因開放讀碼框內(nèi)的所有堿基，擴增序列的第519位發(fā)生了G-A突 變，但并不影響其編碼的氨基酸序列，ACG及ACA編碼的均為蘇氨酸。

2．3 克隆序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2．3．1 54C1基因的氨基酸序列

利用ExPASy中的Trans1ate程序?qū)AG1基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列，可知其編碼336個氨基酸，結(jié)果如下：

2．3．2 物理化學(xué)特性分析

通過protparam(http://us.expasy.org/cgi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化參數(shù)，分析結(jié)果表明，34C1分子質(zhì)量為83495.2，理論等電點為5.04，在哺乳動物、大腸桿菌、酵母中的半衰期分別為4.4h(體外)、＞20h(體內(nèi))、＞10h(體內(nèi))，不穩(wěn)定指數(shù)為46.93，脂溶性指數(shù)為24.73，兩親性指數(shù)為0.82。

2．3．3 保守結(jié)構(gòu)域搜索

利用NCBI的CDD程序?qū)AG1的保守結(jié)構(gòu)域進行搜索，結(jié)果顯示SAG1有兩個保守結(jié)構(gòu)域，分別位于其氨基酸序列的54～176位及184～300位，這兩個保守結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)弓形蟲對宿主細(xì)胞的粘附以及引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的過程中起到了重要作用。

2．3．4 氨基酸功能域搜索

采用InterPro程序?qū)WISS-PR07蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行檢索，對SAG3的氨基酸功能域進行預(yù)測，對搜索結(jié)果進行分析總結(jié)，推測SAG3的氨基酸功能域可能位于54～176位與184～301位之間。

2．3．5 二級結(jié)構(gòu)和折疊類型預(yù)測結(jié)果

NPS同源比對發(fā)現(xiàn)SAG1二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋，β-折疊和不規(guī)則卷曲組成，其中α-螺旋占18.75％，β-折疊占27.71％，無規(guī)則卷曲占59.71％。

2．3．6 信號肽預(yù)測

利用Singa1 IP3.0及PSOR了http://psort.nibb.ac.jp/form.htm1服務(wù)器對SAG1進行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示其編碼的氨基酸序列的前47個氨基酸為信號肽序列。

2．3．7 蛋白跨膜螺旋及亞細(xì)胞定位預(yù)測

應(yīng)用PSORT Prediction對SAG1進行跨膜螺旋及亞細(xì)胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其跨膜域位于第320～336位，為典型的Ia型跨膜蛋白，為GPI錨定蛋白，存在于細(xì)胞膜上的可能性為91％，在溶酶體膜上存在的可能性為20％，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和腔內(nèi)存在的可能性各為10％。

3 討論

自Burg JL對弓形蟲sA C1的全部基因序列發(fā)表后，國內(nèi)外一些學(xué)者對弓形蟲幾個分離株進行PCR克隆、測序、表達(dá)，國內(nèi)的陳曉光等曾試過在不同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)SAG1，包括在大腸桿菌中的非融合的pBV220系統(tǒng)和融合的pRSE了系統(tǒng)以及桿狀病毒系統(tǒng)，龔婭等以及陳曉光等分別構(gòu)建了弓形蟲重組質(zhì)粒pET-SAC1，使SAC1在PET系統(tǒng)中表達(dá)，朱翔等構(gòu)建了PGEX-SAC1重組質(zhì)粒，使其在PGEX系統(tǒng)中表達(dá)，我們從弓形蟲RH株的基因組中成功的克隆擴增出了SAC1基因序列，經(jīng)測序證明，僅第519位發(fā)生了G-A突變，且為無意突變，并利用ExPASy中的Trans1ate程序?qū)AC1基因的核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)氨基酸序列后，利用生物信息學(xué)軟件分析得出其具有一定的疏水性，具有信號肽序列，信號肽剪切位點約位于第47位，為GPI錨定蛋白，跨膜域位于320～336位，為典型的Ia型跨膜蛋白，與國外學(xué)者實驗鑒定結(jié)果相符合。

弓形蟲之所以能夠廣泛的入侵多種宿主細(xì)胞得益于分泌于其蟲體表的多種表面蛋白，SAC1是弓形蟲速殖子期分泌的主要表膜蛋白，研究發(fā)現(xiàn)弓形蟲的多種表面蛋白中至少有20種與SAC1結(jié)構(gòu)相關(guān)，它們被稱為SAC1相關(guān)蛋白超家族(SAG1-re1ated sequence)，通過對SAC1基因結(jié)構(gòu)與功能的研究，將有利于發(fā)現(xiàn)整個SAG1相關(guān)超家族的功能。

作者簡介：陳莎麗(1983—)，女，山西人，碩士研究生，主要從事寄生蟲分子生物學(xué)研究；江鋼鋒(1958—)，男，廣東人，廣東藥學(xué)院教授，通訊作者，主要從事寄生蟲分子生物學(xué)方向的研究；汪琦(1970—)，女，安徽人，廣東藥學(xué)院副教授，博士，通訊作者，主要從事寄生蟲分子生物學(xué)方向的研究。