乙肝病毒Ｘ基因真核表達(dá)質(zhì)粒及細(xì)胞模型的建立

摘 要：采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴增HBV X基因，定向亞克隆入真核表達(dá)載體pRc/CMV2，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV/X；采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染QSC7701細(xì)胞，篩選陽性細(xì)胞克隆；RT-PCR法檢測HBV X mRNA的表達(dá)情況，westem blotting法鑒定HBX蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，構(gòu)建的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X中包含有完整的HBV X基因片斷，pCMV/X轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞中有HBV X mRNA及HBX蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，成功建立了HBV X穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，為進(jìn)一步探討HBX在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用，提供了一個有價值的細(xì)胞模型。

關(guān)鍵詞：HBV X蛋白：真核表達(dá)；乙型肝炎病毒：細(xì)胞模型

中圖分類號：R575.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0355-06

乙型肝炎病毒X基因(HBV X)及其編碼的多功能蛋白 (HBX)在乙肝相關(guān)的肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。但關(guān)于HBX能否直接轉(zhuǎn)化肝細(xì)胞一直存在著爭議，其原因之一可能是缺乏合適的體外模型，我們以人源性永生化非瘤性肝細(xì)胞株OSG7701為靶細(xì)胞，將HBv X導(dǎo)人OSC7701細(xì)胞，建立表達(dá)HBX蛋白的肝細(xì)胞模型，為探討HBX在HBV相關(guān)HCC的發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供一個有價值的平臺。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 載體、菌株及細(xì)胞株

pGEM-T Easy Vector為美國homeCa公司產(chǎn)品，真核表達(dá)質(zhì)粒pRc/CMV2購自Sigma公司，E.coli DH5a及人源性肝細(xì)胞株QSG7701，為本實驗室保存。

1．1．2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、10mmol/L dNTP為日本Takara公司產(chǎn)品：血清HBV裂解緩沖液為上海申友生物公司產(chǎn)品：快速連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶Apa I和HindⅢ及DNA分子量Marker均為BBI公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、TRANSfection轉(zhuǎn)染試劑盒、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒均為北京TIANGEN生物技術(shù)公司產(chǎn)品；胎牛血清購自杭州賽樂生物公司：高糖DMEM為美國GIBCO公司產(chǎn)品：G418、蛋白分子量Marker為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；Trizol為美國MRC公司產(chǎn)品：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品；鼠抗人HBX單克隆抗體為德國abcam公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、硝酸纖維素膜為ProMab公司產(chǎn)品：蛋白質(zhì)抽提試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均為PIERCE公司產(chǎn)品。

1．1．3 引物

針對人HBV X基因序列的PCR引物由于akara公司合成，引物源于已發(fā)表的序列，正義5'-AAA GCTTCCA TG GCTGCTCGGGGTTG-3'：反義5'-A GGGCCCTTA GGCAGAGGTGAAAAAG-3'(正義鏈含有HindⅢ酶切位點和起始密碼子，反義鏈含Apa I酶切位點和終止密碼子)，目的片斷大小為481bp.人β-actin，actin引物由北京鼎國生物公司合成，正義5'-TAACTGGAACGGTGAAGGTG-3'：反義5'-AGGGCACGAAGGGGCTCATCAT-3'，目的片斷大小為316bp。

1．2 方法

1．2．1 HBV X基因的擴增與克隆

采乙肝患者靜脈血(經(jīng)湘雅醫(yī)院感染病科實驗室檢測乙肝三項定量示：HbsAg陽性，HbeAg陽性，ttbcAb陽性)，以堿裂解法提取DNA，以此為模板，擴增HBV X基因片斷，反應(yīng)體系為25μL，其中含模板DNA 3μL，dNTP 1μL，上下游引物2μL，Taq DNA polymerase lμL，擴增條件為95℃5min，94℃50s，57℃50s，72℃1min，共擴增35個循環(huán)，最后72℃8min，用1.0％低熔點瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化目的片斷，與pGEM-了載體連接，連接產(chǎn)物命名為pGEM/X，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coli DH5a，Amp的LB/X-gal選擇性培養(yǎng)基篩選白色菌落，增菌后堿裂解小量抽提法提取質(zhì)粒，Apa I/HindⅢ雙酶切鑒定。

1．2．2真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X的構(gòu)建及鑒定

小量提取真核表達(dá)載體pRc/CMV2及重組質(zhì)粒pGEM/X，分別用Apo I和HindⅢ雙酶切，X基因及質(zhì)粒載體均用1.0％瓊脂糖凝膠電泳、凝膠回收試劑盒回收純化。用快速連接試劑盒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物命名為pCMV/X，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，挑取陽性單菌落，增菌并提取質(zhì)粒，ApaI/HindⅢ雙酶切鑒定，并送上海生工生物工程公司測序。

1．2．3 QSG7701細(xì)胞的培養(yǎng)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

QSG7701細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5％V/V C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至約85％的融合狀態(tài)進(jìn)行傳代，按TRANSfection轉(zhuǎn)染試劑盒提供的方法，以質(zhì)粒pRc/CMV2及pCMV/X，分別轉(zhuǎn)染QSG7701，實驗分3組，分別為QSG7701細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組：QSG7701轉(zhuǎn)染pRc/CMV2組(簡稱pRcCMV2/QSG)，QSG7701細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV/X組(簡稱pCMV X/QSG)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒4d后，在3組細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中加入G418篩選，前2dG418濃度為200mg/L，然后將G418加量為400mg/L，共篩選2周，隔天換液，直至未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陰性對照組全部死亡，而轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞有抗性克隆出現(xiàn)，以200mg/L G418維持篩選20d，然后挑取單個克隆擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，即pCMV X/QSG和pRcCMV2/QSG細(xì)胞系。

1．2．4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的基因DNA的鑒定

用細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的基因DNA，PCR法擴增鑒定HBV X基因。

1．2．5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA的提取及PT-PCR鑒定

采用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的總RNA。通過RT-PCR擴增HBV X mRNA基因。

1．2．6 表達(dá)產(chǎn)物的Western blottin~鑒定

在冰上按蛋白提取試劑盒操作步驟提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，加入適量2XSDS凝膠加樣緩沖液(50mmol/L Tris HCl，pH 6.8；100mmol/L DTT：2％SDS；0.1％溴酚藍(lán)；10％甘油)，100℃煮沸3min，使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜在5％脫脂牛奶(5g脫脂牛奶+100mL PBS)中室溫封閉1h，分別加入特異性HBX抗體(1:50)和GAPDH抗體(1:2000)，37℃水平搖床孵育1h，4℃過夜，PBS充分洗滌后分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗。即猴抗羊IgG(1:1000)和羊抗鼠IgG(1:1000)，37℃水平搖床孵育2h，充分洗滌后，化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)A液和B液混合后加至硝酸纖維素膜上，暗示曝光3～5min，取出X光片，顯影，定影觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2．1 PCR擴增血清中I-IBV X基因片斷

以HBV感染者的血清DNA為模板，擴增出HBV X基因片段，瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶出現(xiàn)在500bp左右的位置，與預(yù)計的481bp相符，陰性對照組是以正常人血清中提取的DNA為模板，未擴增出目的片斷，見圖1表明通過PCR方法已從HBV感染者血清中成功擴增出HBV X基因片段，為下一步基因克隆打下了基礎(chǔ)。

2．2 重組質(zhì)粒pGEM/X陽性克隆的篩選及鑒定

PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，挑選白色菌落，增菌提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)Apa I/HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，于500bp左右可見一清晰的條帶，與預(yù)計的481bp相符，表明經(jīng)PCR擴增的X基因片段已成功克隆人pGEM-T載體中，見圖2。

2．3 重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X的篩選及鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X經(jīng)Apa I/HindⅢ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，可見大小兩條清晰的條帶，小分子條帶位于500bp左右，與HBV X基因的大小相符，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X的構(gòu)建是成功的，見圖3。

2．4 重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X測序鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X測序報告所示目的片段序列與GenBank上AYl230 HBV X基因序列一致，測序引物為T7，從第10位至478位堿基為目的片段，見圖4，上述結(jié)果進(jìn)一步證實已成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X。

2．5 G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞及克隆形成

質(zhì)粒pCMV/X和pRc/CMV₂分別轉(zhuǎn)染QSG7701細(xì)胞后，經(jīng)G418篩選2周后。作為陰性對照的未轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞全部死亡，轉(zhuǎn)染細(xì)胞組有抗性細(xì)胞克隆出現(xiàn)，分別獲得pCMV X/QSG細(xì)胞陽性克隆8個，pRcCMV2/QSG細(xì)胞陽性克隆6個，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與正常QSG7701細(xì)胞相比無明顯變化，仍表現(xiàn)出上皮樣細(xì)胞的特點，為扁平的多角形細(xì)胞，見圖5.200 mg/L G418維持篩選的過程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞克隆逐漸增多，增大，肉眼觀察可見白色的細(xì)胞克隆，pCMV X/QSG組共25個，pRcCMV2/QSG組共19個，上述結(jié)果表明。重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X及質(zhì)粒pRc/CMV2已分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染QSG7701細(xì)胞，并已分別獲得相應(yīng)細(xì)胞克隆。

2．6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HBV X基因鑒定

pCMV X/QSG細(xì)胞DNA經(jīng)PCR擴增后，在500 bp下方出現(xiàn)一特異性條帶，與預(yù)期片段大小481 bp一致，電泳條帶清晰，無雜帶，無拖尾，而pRcCMV2/QSG及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的QSG7701細(xì)胞DNA經(jīng)PCR擴增后均未見特異性片段，見圖6，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pCMV X轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞中包含目的基因片段HBV X。

2．7 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HBV X mRNA的表達(dá)

從3種細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，分別進(jìn)行RT-PCR擴增反應(yīng)，結(jié)果顯示pCMV X/QSG組在500 bp附近出現(xiàn)清晰的條帶，與預(yù)期的481 bp吻合。而pRcCMV2/QSG及QSG7701組無目的條帶出現(xiàn)，表明在pCMV X/QSG細(xì)胞中存在HBVX轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)，見圖7，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pCMV X轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞能特異性地表達(dá)HBV X mRNA。

2．8 Western Blotting檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HBX的表達(dá)

pRcX/QSG細(xì)胞提取蛋白在分子質(zhì)量約17kD處可檢測到特異性蛋白條帶，與HBVX蛋白的理論分子質(zhì)量是一致的。而pRcCMV2/QSG及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的QSG7701細(xì)胞抽提蛋白則未見HBV X蛋白表達(dá)，見圖8，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pCMV X轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞能特異性地表達(dá)HBV X蛋白。

3 討論

在HBV編碼的蛋白質(zhì)中，HBX是一種由154個氨基酸殘基組成的多功能蛋白，大量研究表明，即使HBX對HBV的感染不是絕對必須的，它也至少在HBV的復(fù)制中起著關(guān)鍵的作用，因而HBX與HBV的生命周期、致病機制甚至HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，HBX具有廣泛的反式激活功能，它雖然不能與DNA直接接合，但可以通過蛋白，蛋白相互作用，激活多種信號傳導(dǎo)通路(如FasL/Fas、JAK/STAT、Ras/Raf和JNK傳導(dǎo)通路等)，來調(diào)節(jié)各種信號蛋白及原癌基因的表達(dá)，而這些蛋白常參與細(xì)胞增殖、有絲分裂、分化及惡性轉(zhuǎn)化等生理病理過程，HBX長期緩慢激活信號傳導(dǎo)途徑，類似于弱的腫瘤促進(jìn)劑，這已成為HBX致癌的熱點機制。

目前，關(guān)于HBX在HBV感染及HCC發(fā)生發(fā)展中所起的確切作用仍存在很大爭議，許多研究結(jié)果甚至相互矛盾，在HBX漫長的致癌過程中，有許多因素在不同階段參與作用，全面研究HBX生物學(xué)特性，將有助于揭示HBV相關(guān)HCC的發(fā)生和發(fā)展機制，為了進(jìn)一步探討HBX在HCC發(fā)生過程中所起的作用及其確切的分子機制，建立恰當(dāng)?shù)募?xì)胞、動物模型是至關(guān)重要的，然而，在轉(zhuǎn)基因的肝細(xì)胞模型中，大多是以人或鼠肝癌細(xì)胞如HepG2、HepG2.2.15、QGY7701、Huh7等為研究對象，來探討HBX在肝癌細(xì)胞的凋亡、分化與增殖中的信號傳導(dǎo)通路，以及細(xì)胞癌基因的激活等方面所起的作用，而對HBV X基因及HBX蛋白對非瘤性肝細(xì)胞的影響研究甚少，HBX能否轉(zhuǎn)化正常肝細(xì)胞甚至瘤性轉(zhuǎn)化正常肝細(xì)胞?目前在這方面的報導(dǎo)極少。

因此，本研究選用了人源性非瘤性肝細(xì)胞QSG7701為研究對象。將含全長HBV X基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X轉(zhuǎn)染QSG7701細(xì)胞，建立HBV X穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞模型，以探討HBX對正常人肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，首先，HBV X真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的成功與否，關(guān)系到細(xì)胞模型中HBX的表達(dá)，直接影響到實驗的結(jié)果，也是目前關(guān)于HBX的研究結(jié)果出現(xiàn)分歧的原因之一，本實驗中。我們選用的真核表達(dá)載體為pRc/CMV2，在其強大的啟動子SV40和CMV的作用下，HBV X基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中實現(xiàn)了高水平的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，為建立理想的細(xì)胞模型打下了基礎(chǔ)。

在擴增HBV感染者血清中HBV X基因的引物設(shè)計及選擇方面，我們考慮到HBV共有8種基因型(A-H)，基因型的差異可以引起HBX氨基酸的差異。而這些差異可導(dǎo)致HBX反式激活功能的不同，至于是否會導(dǎo)致不同的臨床及病理表現(xiàn)，目前還不確定，亞洲地區(qū)HBV主要基因型為B型和C型，而中國人以adr亞型為主，故我們擴增HBV X的引物設(shè)計是針對adr亞型HBV X的基因序列，并成功地從“大三陽”且HBV DNA陽性患者的血清中擴增出目的HBV X片段，真核重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV/X測序目的基因，其結(jié)果與PubmedGenBank中adr亞型的HBV又序列吻合。

在HBV感染的哺乳動物中，宿主基因組DNA中常有一個或多個位點上整合有HBVDNA，這種整合可影響到癌基因或(和)抑癌基因的表達(dá)，在HCC的發(fā)生中起著一定作用，而在HBV的4個開放閱讀框中，X基因是最容易整合的序列，可以部分或全部整合至宿主DNA中，在轉(zhuǎn)染了HBV X的細(xì)胞中，外源基因是否整合至宿主DNA是隨機的，這正好模擬了人類HBV感染后，HBV X基因的整合，在本研究中，經(jīng)HBVX轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞克隆經(jīng)PCR，RT-PCR和West，ern Blotting證實， 目的基因HBV X已導(dǎo)人QSG7701細(xì)胞中，并有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及蛋白的表達(dá)，說明HBV X是全部整合至細(xì)胞基因組DNA中，獲得了可穩(wěn)定表達(dá)HBX的肝細(xì)胞株pCMV X/QSG，為下一步體外研究HBX對正常人肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，及體內(nèi)研究HBX的致瘤性打搭建了一個好的平臺。基于這個平臺，我們可以從多方面研究HBX在HBV感染和誘發(fā)HCC中的作用。

作者簡介：李濤(1986—)，女，湖南湘鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事乙型肝炎相關(guān)研究，現(xiàn)在上海市公共衛(wèi)生臨床中心重癥肝病ICU病房工作；劉國珍(1963—)，男，湖南寧鄉(xiāng)人，教授，醫(yī)學(xué)博士，通訊作者，主要從病毒性肝炎基礎(chǔ)與臨床研究，曾在美國貝勒醫(yī)學(xué)院從事相關(guān)研究工作近3年。