遺傳性β地中海貧血?。茫模保伏c突變的快速簡便檢測

摘 要：利用聚合酶延伸技術及雙鏈特異性嵌入染料的特性，建立了一種快速簡便的基因點突變的檢測方法，在特定引物聚合過程中，不同基因型的聚合反應進程被實時轉換為熒光信號，通過監測熒光信號的變化實現基因點突變的快速檢測，不需要復雜的凝膠電泳、熒光和同位素標記等操作，通過對β珠蛋白基因CD17點突變的檢測，證實該方法是一種廉價、簡便、快速的篩查遺傳性地中海貧血病β珠蛋白基因CD17點突變的方法，該方法可擴展到各種基因的點突變檢測。

關鍵詞：點突變；聚合酶；遺傳性地中海貧血??；基因突變篩查

中圖分類號：Q319.31 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0295-06

β地中海貧血病(β地貧)是由于β珠蛋白基因的突變或缺失導致的構成血紅蛋白HbA(α2β2)的盧珠蛋白肽鏈合成減少或不能合成，造成α與β肽鏈合成失衡所引起的一種常染色體隱性遺傳病，若胎兒同時接受來自父母的兩個β地貧基因，則為突變純合子，絕大多數表現為重型β地貧疾病，目前尚無有效療法，這些病人往往幼年夭折或靠輸血維持生命，通過基因檢測預防地貧患兒的出生是控制該遺傳病的可行方法。

β-地貧基因常以點突變最為常見，β珠蛋白基因的CDl7(A→T)點突變是最早報道的與β地貧疾病相關的點突變之一，β地貧基因突變的傳統檢測方法是以凝膠電泳為基礎的方法。操作繁瑣復雜，費時長，目前常用的診斷方法是聚合酶鏈反應結合斑點雜交技術，該方法準確性高，但需要放射性同位素標記和繁瑣的分子雜交技術：Pun等報道了一種變性高效液相色譜基因分型新技術，無需放射性同位素標記，但這種方法操作復雜，儀器昂貴，實驗周期長；新發展起來的實時熒光PCR技術已用于遺傳性血色病HFE基因點突變檢測，操作簡便，但探針的設計難度和檢測儀器成本較高，限制其廣泛應用，

利用雙鏈結合染料嵌入雙鏈DNA發出熒光的原理，我們建立了一種在常溫下實時檢測聚合酶活性的簡便方法，本文在此基礎上，基于聚合酶延伸技術和雙鏈特異性嵌入染料特性，發展了一種快速簡便的點突變實時檢測方法，該方法通過染料的嵌入和熒光信號的變化實現點突變檢測，不需昂貴儀器，也不需復雜的凝膠電泳操作和標記等過程，操作方便、簡單，利用該方法，對β地貧疾病相關的CD17突變進行了檢測，該方法為基因點突變及單核苷酸多態性的檢測提供了一個快速簡捷的有效方法，為藥物篩選、疾病防治和單倍型計劃提供一種新的手段和思路。

1 實驗

1．1 試劑與儀器

試劑：引物及寡核苷酸由大連寶生物公司(Takara)合成，序列見表1.Klenow Fragment(exo-)聚合酶(KF-酶，Fermentas)，SYBR Green I(上海科技發展有限公司)，TakaRa Ex taq酶(Takara)，dNTP Mixture(Takara)，Tris(Sigma)，二硫蘇糖DTT(Bebco)，其它試劑均為國產分析純，實驗所用水均為過濾除菌的高純水，實驗器皿均經過高溫滅菌，儀器：美國Perkin Elmer LS-55熒光分光光度計，美國Amersham恒溫水浴，ABI公司Ce-neAmP^TM PCR System 2700。

1．2 實驗方法

1．2．1 熒光測定

本研究選用雙鏈特異性結合染料SYBRGreen I，熒光強度的測定用497 nm光激發，在520nm處檢測，儀器的入射狹縫與發射狹縫都設為2.5nm，樣品除特別指出均在37℃恒溫10min熒光值穩定后測定，樣品溶液終體積均為200μL。

1．2．2 點突變檢測

配制底液1(100nmol/L引物N3，50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，5mmol/L MgCl₂，1mmol/LDTr.50 μmol/L dNTP Mixture，1×SYBR GreenI)，分別在底液1中加入終濃度為100nmol/L的N1、N2和終濃度為50nmol/L的N1/N2，配制成A、B、C 3種樣液，配制底液2(100nmol/L引物N4，50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，5mmol/LMgCl₂，1mmo|/L DTF，50μmol/L dNTP Mixture(相同比例)，1×SYBR GreenI)，分別在底液2中加入終濃度為100nmol/L N1、100nmol/L的N2和終濃度為50nmol/L的N1/N2，配制成D，E，F3種樣液。熒光強度穩定后分別加入2.5U KF-酶，連續監測熒光強度的變化。

1．2．3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

利用傳統電泳方法驗證點突變檢測結果。樣液A、B、C分別在95℃變性5min，然后在O℃驟冷5s，用含7％尿素的20％聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染分析。

1．2．4 溫度對檢測的影響

分別在25、30、34、37、42、47℃向樣液A中加入2.5U KF-酶，監測熒光強度變化，以聚合反應1000s時的熒光信號值與未加聚合酶的熒光本底的比值(S/B)為考察標準，考察溫度對檢測體系的影響。

1．2．5 金屬離子對檢測的影響

考察M²⁺、Ca²⁺、K⁺、Na⁺4種金屬離子對聚合酶聚合的影響，調整樣液A中MgCl2的濃度，考察Mg²⁺的影響；在樣液A中分別加入CaCl₂、KCI、NaCl溶液調整到不同濃度，參考文獻[11]計算反應初速度，考察離子對聚合反應的影響。

1．2．6 地中海貧血遺傳病點突變樣品的制備以及檢測

我們對地中海貧血遺傳病的一種CDl7(A→T)點突變進行檢測，10份樣本(3份突變純合子和3份雜合子來自南方醫科大學醫學遺傳室，4份正常人樣本來自本實驗室)，樣品的基因組總DNA按標準DNA提取技術從病人和正常人的外周血的白細胞中提取，引物(表1)按Primer 5.0設計，PCR體系(50νL)含有：0.5U的TakaRa Extaq酶，0.2mmol/L dNTP Mixture，1×PCR緩沖液，800nmol/L N6，10nmol/L N7及50ng總DNA，PCR反應程序如下：94℃變性5min，然后按94T變性30s，57℃退火35s，72℃延伸30s，循環40次，標準凝膠電泳法純化PCR產物并檢測OD值，在底液3(100nmol/L引物N5，50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，5mmol/L MgCl₂，1mmol/LDTT，50μmol/L dNTP Mixture，1×的SYBR GreenI)中進行檢測。

2 結果與討論

2．1 實驗原理

實驗原理見圖1，設計特定等位基因引物，其3′末端終止于模板的突變(多態性)堿基位點，當模板與引物完全匹配時，引物在聚合酶的作用下延伸形成雙鏈，雙鏈特異性染料插入新生的雙鏈區域，熒光強度增強，而當模板與引物3′末端不匹配時，引物不能有效進行延伸反應，沒有熒光信號的變化。通過觀察熒光信號的變化。實現點突變檢測。

2．2 點突變檢測方法

根據文獻[13～15]，我們用人工合成的寡核苷酸模擬地中海貧血遺傳病CD17點突變靶序列(表1)，N1和N2分別代表點突變的兩種純合子基因型。50％的N1/N2的混合樣品模擬雜合子基因型，圖2是利用特定等位基因引物進行點突變檢測的結果，引物N3的3′末端終止于突變堿基位點，并與N1純合子完全匹配，在聚合酶作用下，互補的dNTP逐個被加到引物3′-OH末端形成雙鏈結構，染料SYBR Green I嵌入雙鏈產生熒光，隨時間延長，熒光信號逐漸增強(曲線1)；當模板是N2純合子時，引物N3的3′端與其不匹配，不能有效發生聚合延伸反應，沒有明顯的熒光信號增加(曲線3)；當模板是雜合子型時，熒光信號也有顯著的上升(曲線2)，但是其熒光增長速度明顯小于曲線1，通過熒光的變化，3種基因型得以有效區分，為了更好的進行點突變檢測，我們還利用與N2純合子完全匹配的引物N4來進行檢測，當模板是N1時，加入聚合酶，由于引物N4的3，端與其不匹配，熒光信號沒有明顯變化；當模板是N2時，隨著DNA聚合酶的加入，熒光信號迅速增強，當模板是雜合子型時，熒光也有增強，但是增長程度小于完全匹配的模板N2，這個檢測結果與使用N3引物檢測時相同(圖未顯示)。

2．3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

我們用傳統的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對點突變檢測結果進行驗證，圖3中泳道1～3分別為N1、N2和N3的條帶；泳道4～6分別是樣液A～C的反應樣液，我們發現，泳道4中(樣液A)，由于引物N3以N1為模板進行聚合反應，引物N1帶消失，而在模板N1帶的上方出現了一條聚合產物帶(為了區分聚合反應生成的產物和原有的模板，設計的引物5′端相對模板N1多出2個堿基“AG”，因此條帶4的模板上方的新帶為聚合產物)；泳道5(樣液B)由于不能發生有效的聚合反應，模板N2與引物N3帶繼續存在：泳道6是樣液C的反應液，可見引物帶、模板與聚合產物帶，但是聚合產物帶與泳道4相比，亮度減弱，說明聚合反應產物較泳道4少，以上電泳結果與熒光實驗結果一致，說明此熒光分析方法是一種可靠、準確的基因分型方法。

2．4 溫度對檢測的影響

調整恒溫水浴使溫度分別控制在25、30、34、37、42、47℃，向樣液A中加入聚合酶，監測熒光強度的變化，結果如圖4所示，由圖4可知，隨著溫度的升高，熒光信號與未加聚合酶的熒光本底的比值(S/B)升高，但是當溫度超過37℃時，S/B值下降，因此點突變檢測時選擇37℃作為檢測溫度。

2．5 金屬離子對檢測的影響

點突變檢測是基于聚合酶延伸反應進行的。聚合酶的聚合效率對該方法信號的產生及靈敏度有重要影響，我們分別考察了幾種重要金屬離子(Mg²⁺，Ca²⁺、K⁺、Na⁺)對聚合反應的影響(圖5)，從圖中可以看出：當M廣不存在時，不能發生聚合反應，隨著Mg2~濃度的增加，反應初速度增加，當Mg²⁺濃度達到10～15mmol/L時，反應初速度最大，當其濃度繼續增加時，對聚合酶的活性有一定抑制作用，這說明了Mg²⁺作為聚合酶的激活劑在反應中是必不可少的；而低濃度的Ca²⁺(小于20mmol/L)對聚合酶的活性影響不大，當Ca²⁺濃度大于30 mmol/L。對反應速度有明顯的抑制作用；K⁺和Na⁺的存在均對聚合酶活性有抑制，且隨著濃度的增加，對聚合酶活性的抑制越大，當K，和Na⁺濃度高于100mmol/L時，聚合反應基本上被抑制。

2．6 地中海貧血病點突變的基因分型

地中海貧血是遺傳性血液病，我們對其一種CDl7點突變類型進行了檢測，結果見圖6，從圖中可以看出，在未加聚合酶時，3種基因型樣品的熒光信號相似，但是加入聚合酶后，3種基因型之間顯示出明顯的差異，與引物(N5)完全匹配的突變純合子加入聚合酶后，熒光信號劇烈上升(曲線1)；野生型純合子加入聚合酶后，熒光信號沒有明顯變化(曲線3)；而雜合子加入聚合酶后，熒光信號也有較大增長。但熒光比突變純合子明顯低(曲線2)，通過染料分子的加入和熒光信號的觀察，方便、快速、準確的將CDl7(A→T)點突變區別鑒定。

3 結論

基于聚合酶延伸技術，通過雙鏈特異性熒光染料嵌入，直接以熒光信號的變化給出點突變基因分型結果，該方法不需要對引物和寡核酸進行放射性同位素標記或熒光標記。成本低；實驗操作簡單，不需凝膠電泳檢測及復雜昂貴儀器，為預防、篩查點突變導致的遺傳性疾病提供一種簡便快捷的方法，也為單核苷酸多態性的基因分型的單倍型計劃提供了新的思路。

作者簡介：孟祥賢(1972—)，女，湖南華容人，湖南大學副教授，博士，從事分子水平上的生物分析化學研究；王柯敏(1957—)，男，湖南沅江人，湖南大學教授，博士，通訊作者，從事納米及分子水平上的生物分析化學及納米生物技術研究。