腎小球系膜細胞中硫氧還蛋白１過表達對基質金屬蛋白酶９表達的影響

摘 要：為進一步探討硫氧還蛋白1(thioredoxinl，Trxl)過表達對高糖環境下腎小球系膜細胞基質金屬蛋白酶9(Matrix metauoproteinase 9，MMP9)表達的影響，采用RT-PCR和明膠酶譜法檢測細胞中MMP-9 mRNA和酶活性的變化，用脂質體介導瞬時轉染法轉染正義TIxl及反義Trxl，觀察高糖環境Trxl過表達對MMP9表達的影響，結果表明，HBZY-l高糖組與正常糖組比較，MMP9 mRNA在12h，24h，48h時表達增加(P＜0.05)，同時酶活性于12h、24h、48h也明顯增高(P＜0.01)，轉染正義Trxl組細胞，MMP-9 mRNA水平及MMP9酶活性，在高糖組與正常糖組差異無統計學意義(P＞0.05)；但轉染反義Trxl組和未轉染組細胞的MMP9 mRNA水平及酶活性，高糖組均比正常糖組表達增加，差異有統計學意義(P＜0.01)，提示Trxl過表達可抑制高糖環境誘導的腎小球系膜細胞MMP9高表達。

關鍵詞：硫氧還蛋白1：基質金屬蛋白酶9；腎小球系膜細胞；瞬時轉染

中圖分類號：R587.2 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0361-06

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并發癥之一，其主要病理特點為腎臟系膜區系膜細胞增生，大量細胞外基質堆積。系膜區變寬或結節形成及腎小管腎小球基底膜增厚等，系膜區系膜細胞增生，細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)積聚是DN的特征性病理改變，近年關于ECM降解異常的研究已開始受到關注，基質金屬蛋白酶類(Matrix metalloproteinases。MMPs)是參與降解ECM的蛋白酶家族，其表達異常是ECM降解異常的重要原因，MMP9作為一種重要的降解ECM的基質金屬蛋白酶已引起人們廣泛關注，已有研究報道，細胞內氧化應激水平可影響MMP9的表達水平，硫氧還蛋白1是細胞內一種重要的抗氧化蛋白，具有多種生物學功能，如抗氧化應激、促生長、抑制凋亡等，而關于細胞內抗氧化蛋白對MMP9水平的影響目前尚屬空白，本實驗擬觀察高糖環境下Trxl過表達對MMP9表達的影響，為DN系膜細胞外基質生成的調控研究奠定理論基礎，也為其治療與預防提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗細胞株與質粒

大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1)購自武漢大學生物保藏中心，人Trxl的重組質粒(PIRESpur03-sense thioredoxin-1，PIRESpur03-anti thioredoxin-1)由美國范德堡大學David P.Carbone教授饋贈。

1．1．2 試劑

Trizol、RT-PCR試劑盒、LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司： 抗人Trxl多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體均購自Santa cruz公司：辣根酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL plus購自Amersham公司：DMEM，RPMI-1640購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青生物技術公司；胰酶、明膠(gelatine)購自Sigma公司；其它試劑均為進口或國產分析純。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養

HBZY-1常規培養于10％胎牛血清RPMI-1640培養液中，培養條件為37℃，飽和濕度5％C02，每2～3d用0.25％胰酶消化傳代。

1．2．2 RT-PCR

Trizol一步法從細胞中提取mRNA，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定mRNA質量，紫外分光光度計測定總mRNA的濃度及純度，取1μg總mRNA經RT-PCR試劑盒逆轉錄得到相應的cDNA，取上述逆轉錄cDNA作模板進行PCR擴增(引物序列見表1)，擴增條件為94℃預變性2min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環后于72℃延伸10min，擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，紫外凝膠成像系統進行半定量分析。

1．2．3 明膠酶譜分析法

取含10μg蛋白的細胞上清與不含點，巰基乙醇的蛋白上樣緩沖液(0.125mol/L Tris-HCl pH6.8，10％甘油，2％SDS，0.01％溴酚藍)混勻，在含0.1％明膠的10％SDS-PAGE中分離，以洗膠緩沖；液(2.5％ Triton X-100，5mmol/L CaCl₂，1μmol/LZnCl₂，50mmol/L Tris-HCl pH 7.4)洗膠1h，后置于反應緩沖液(1％Triton X-100，5mmol/LCaCl₂，1μmol/L ZnCl₂，50mmol/L，Fris，HCIpH 7.4)中37℃孵育過夜，經0.35％考馬斯亮藍染膠后用脫色緩沖液(甲醇25％，冰醋酸10％)脫色以顯色條帶，用掃描儀掃描濕膠，以密度分析軟件(PDI Inc，Quantity One，Version 2.5)測定各條帶的密度并以此行酶活性分析，實驗重復3次。

1．2．4 Western印跡

取細胞總蛋白70μg，經15％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳完畢后凝膠上的蛋白以電轉移至硝酸纖維素膜，5％脫脂奶粉封閉，一抗37℃孵育1h 30min、二抗37℃孵育1h，ECL plus檢測，同時以β-actin作內參照，Trxl一抗1:1000，二抗1:5000；β-actin一抗1:500，二抗1:5000，實驗結果使用BIORAD GS-800系統掃描，并定量分析X光片條帶的光密度，實驗重復3次。

1．2．5 轉染

轉染前24h細胞傳代。以4×10⁵/mL細胞密度接種于六孔板中，細胞密度達70％～90％時進行轉染，用250μL無血清培養基稀釋4μg質粒混勻，同時用250μL無血清培養基稀釋10μL轉染試劑，室溫放置5min，將上述兩種復合物混合，室溫放置20min，將復合物加入到細胞中，輕輕晃動，混勻，6h后換液，48h收細胞。

1．2．6 統計學分析

采用SPSS10.0統計軟件進行數據處理，雙側檢驗以P＜0.05判定差異有統計學意義，組間資料采用配對t檢驗，所有數據以均數±標準差x±s)表示。

2 結果

2．1 RT-PCR檢測正常糖和高糖環境下MMP-9mRNA表達水平

各時間點正常糖組和高糖組MMP9 mRNA表達結果顯示，12h高糖組(HG)是正常糖組(NG)的146±11.3％，差異有統計學意義(^*P＜0.05)；24h HG組是NG組160.9±8.9％，差異有統計學意義(^*P＜0.05)；48h HG組是NG組189±13，6％，差異有統計學意義(^*P＜0.05)(見圖1)，實驗結果表明，高糖環境可以引起MMP9 mRNA表達增高。

2．2 明膠酶譜法觀察正常糖和高糖環境下HBZY-1培養液上清中MMP-9活性的變化

各時間點正常糖組和高糖組細胞上清中明膠酶MMP9活性顯示，12h HG組是NG組的164.75±18.7％，差異有統計學意義(P^**＜0.01)，24h HG組是NG組的163.58±12.4％，差異有統計學意義(p^**＜0.01)，48 h HG組是NG組的136.96±9.7％，差異有統計學意義(^**＜0.01)，結果表明，48h內高糖環境可誘導明膠酶MMP9活性增強(見圖2)。

2．3 HBZY-1細胞中正義和反義Trxl質粒轉染

2．3．1 RT-PCR檢測轉染正義和反義Trxl質粒

RT-PCR結果顯示：以β－actin為內參照，轉染正義Trxl和反義Trxl組，在421 bp處均有明顯的條帶，此條帶與人Trxl吻合，正常對照組此處無條帶(圖3)，實驗結果表明。HBZY-1成功轉染正義和反義Trxl質粒。

2．3．2 Western blotting檢測轉染正義和反叉7rxl質粒

Western blotting結果顯示：以β-actin為內參照，正義Trxl組與反義Trxl組和正常對照組比較，Trxl蛋白表達明顯增高(見圖4)，實驗結果表明，正義Trxl質粒在HBZY-1中已表達Trxl蛋白。

2．4 Trxl過表達對HBZY-1中MMP9表達水平的影響

2．4．1 Trxl過表達對HBZY-1中MMP9 mRNA水平的影響

以β－actin為內對照，在轉染正義Trxl質粒的細胞中(1組，2組)，HG組MMP9 mRNA表達水平和NG組差異無統計學意義(P＞0.05)；在轉染反義Trxl質粒的細胞中(3組，4組)，HG組MMP9mRNA表達水平是NG組的163±12.7％，差異有統計學意義(P^**＜0.05)；在未轉染的細胞中(5組，6組)，HG組MMP9 mRNA表達水平是NG組的134±13.7％，差異有統計學意義(P^**＜0.05)，且在正常糖環境下，1、3和5組MMIO mRNA表達水平差異無統計學意義(P^**＞0.05)(見圖5)，實驗結果表明，正義Trxl蛋白可以抑制高糖環境誘導的MMP9 mRNA水平的增高。

2．4．2 明膠酶譜法檢測Trxl過表達對正常糖和高糖環境下MMP-9活性的影響

轉染正義Trxl質粒細胞上清中，HG組MMP9酶活性是NG組的103±13.5％，二者差異無統計學意義(P＞0.05)；轉染反義Trxl質粒細胞上清中，HG組MMP9酶活性是NG組的137.13±11.6％，差異有統計學意義(P^**＜0.01)：未轉染組細胞上清中，HG組MMP9酶活性是NG組的122±14.2％，二者差異有統計學意義(P^**＜0.01)(圖6)，在正常糖環境下，1、3和5組MMP-9酶活性，差異無統計學意義(P^b＞0.05)。實驗結果表明，正義Trxl抑制高糖誘導的MMP9酶活性增高。

3 討論

DN關鍵病理過程為系膜細胞增生，細胞外基質積聚和基底膜增厚，系膜基質的成分與含量取決于基質合成與降解之間的平衡，早先的研究主要集中在系膜基質合成方面，而降解能力下降在DN發病中的重要作用近期才開始受到關注，MMPs是一組能降解ECM的鋅依賴Ⅱ型蛋白酶，對ECM有廣泛的降解作用。是調節ECM動態平衡的最重要的一大酶系，MMP9是參與血管基底膜主要結構成分Ⅳ型膠原降解的蛋白酶，與糖尿病腎病關系密切，已有文獻報道，持續高糖環境，系膜細胞MMP9活性升高而后下降，而MMP9活性的變化直接影響Ⅳ型膠原的表達，ECM積聚，系膜基質環境紊亂，所以，推測高糖環境下MMP9早期變化可能是系膜基質成分失衡的觀測靶點。

本實驗結果表明，HBZY-1在高糖環境48h內MMP9的活性明顯增加，MMP2活性無變化，此結果說明，高糖環境可以影響系膜細胞內MMP9的活性。Hirakawa報道，MMP-9啟動子序列中CA重復序列與DN的關系密切：最近Shiro Uemura報道，高糖環境下細胞外抗氧化劑(N-乙酰半胱氨酸)可以使MMP9啟動子活性減弱，并且這種減弱是通過抗氧化劑降低細胞內活性氧生成增多、減輕細胞氧化應激實現的，

Trxl是細胞內廣泛分布的一種抗氧化蛋白，具有一個高度保守的活性中心位點序列CGPC(-Cys³²-Gly-Pro-Cys³⁵)，通過活性中心催化細胞內氧化還原反應，Trx直接的抗氧化作用主要清除體內的自由基，最新的研究表明Trx系統在機體抗氧化方面起著不可忽視的作用。Trx在糖尿病方面的研究報道，高糖環境下，細胞內活性氧、Trx和Trx相互作用蛋白(Vitamin D3 up-rc8ulatedprotein-l，VDUP or TXNIP)體系與p38信號傳導途徑密切相關，Kobayashi還報道，高糖環境下基因微點陣分析，系膜細胞內Trx相互作用蛋白表達增高，且這種表達趨勢的變化與細胞外基質增多密切相關，但高糖環境下，系膜細胞中Trxl表達水平的改變，以及這種變化是否能影響降解細胞外基質的主要酶-MMP9的表達，目前尚無相關報道。

本實驗選擇正義和反義Trxl質粒，其多克隆位點序列經上海生工測序，測序結果表明：正義Trxl與人的Trxl序列100％吻合，且Westernblotting實驗也驗證了轉染的系膜細胞內Trxl蛋白高表達，本實驗結果發現，轉染正義Trxl組，細胞內MMP9 mRNA的表達水平和酶活性，高糖環境下與正常糖環境比較，無明顯差異；而轉染反義Trxl組和未轉染組中，高糖環境下MMP9 mRNA表達水平和酶活性均較正常糖環境增高，本實驗表明，Trxl蛋白高表達可抑制HBZY-1中高糖誘導的MMP-9表達水平的增高，提示Trxl在高糖環境早期系膜細胞基質環境的穩定中發揮重要的作用。但是，我們知道DN是一種慢性疾病，故本實驗后續將觀察高糖環境下在Trxl穩定轉染系膜細胞中Trxl活性增高對MMP9和膠原IV的變化影響，我們的研究將為Trxl是否直接影響細胞外基質的生成研究奠定理論基礎，同時也為糖尿病腎病的治療提供新的思路。

作者簡介：房紹紅(1972—)，女[朝鮮族]，黑龍江哈爾濱市人，碩士研究生，從事與氧化應激相關的生物大分子功能研究；周宏博(1967—)，女，黑龍江哈爾濱市人，教授，碩士研究生導師，通訊作者，從事與氧化應激相關的生物大分子功能研究。