受精卵反義寡核苷酸顯微注射影響因素的研究

摘 要：以金魚受精卵為材料，通過胚胎培養探討反義寡核苷酸顯微注射劑量、受精卵質量、胰酶消化濃度等對受精卵反義寡核苷酸顯微注射的影響，研究表明，反義寡核苷酸注射劑量在4.6nL、胰酶消化濃度在0.4％的情況下，選用質量較好的受精卵注射，顯微注射效果較好，可為之后的基因功能研究提供材料保障，利用顯微注射法導入反義寡核苷酸來研究基因的功能，是研究基因功能的有效途徑。

關鍵詞：金魚；反義寡核苷酸技術；顯微注射；胚胎培養

中圖分類號：0954.4 文獻標識碼A 文章編號：1007-7847(2007)04-0234-04

反義寡核苷酸技術(Antisense olizonuclcoti-des，ASON)是用一段人工合成的能與RNA或DNA互補結合的寡核苷酸鏈抑制基因的表達，其原理通過阻抑從DNA至mRNA的轉錄過程或從mRNA到蛋白質的翻譯過程，而阻斷細胞中的蛋白質合成，反義寡核苷酸技術具有高特異性、無毒性等特有的優點，近年來在抗病毒、抗腫瘤、細胞凋亡、信號傳導及在遺傳育種、胚胎發育的研究中有愈來愈廣泛的應用，將反義核酸導人體內是反義核酸技術中的重要環節，目前主要方法有：直接微注射、血管壁外聚合藥物轉運系統、氣囊導管定位腔內轉移、改良電穿孔法等，因金魚體外受精體外發育，且個體產卵數量大，胚胎透明，用顯微注射法將反義寡核苷酸(ATc，SCON)直接注入受精卵，可在活體上觀察金魚器官發育，因此該研究方法在研究魚類胚胎發育調控機制有突出的優越性，本實驗室在前期研究工作中發現，Vsxl基因是與金魚眼睛空間模式形成相關的調控基因和分析二倍體依賴型機制的候選目標基因，為了研究候選目標基因Vsxl在金魚發育過程的具體功能及對其下游基因的調控機制，我們采用反義寡核苷酸技術和顯微注射的方法，將反義寡核苷酸(ATG，SCON)直接注入金魚的受精卵，使Vsxl的mRNA不能翻譯成相應的蛋白質，以此探究Vsxl在金魚胚胎發育過程中的功能及其調控方式，顯微注射反義寡核苷酸是該項研究的前提條件，本文探討了影響金魚受精卵反義寡核苷酸顯微注射的客觀因素，為提高反義寡核苷酸顯微注射成功率提供依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試劑

注射用硫酸鏈霉素(100萬單位)，注射用青霉素鈉(80萬單位)均為華北制藥股份有限公司產品；氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、碳酸氫鈉、胰蛋白酶等為國產分析純試劑；優質石蠟油；滅菌ddH₂O；過濾了的曝氣水；過濾了的加了抗生素的隔夜冷開水。

配制5倍濃度的Half’s液(即高滲液)，10倍濃度的Haft’s液；10倍濃度的Half’s液配方：35g NaCI，1g CaCl₂，0.5g KCl溶于1L ddH₂O中，燒開后冷卻通氣，臨用前加NaHCO，配成0.2g/L；將青霉素80萬單位溶于2mL ddH₂O中，取25uL溶解好的青霉素至1L Half’s中，將鏈霉素100萬單位溶于2.5mL ddH20中，取125μL溶解好的鏈霉素至1L Half’s中。

1．1．2 儀器設備

XTB-01型體視鏡購自中國光學儀器廠；NANOLl7ER2000顯微注射系統購自美國WPI公司；注射用的毛細管為WPI公司的Replacement3.5 inch glass capillary(300)；拉針儀為美國Sutter公司生產的P97 Puller；Pr0600ES型顯微照相圖象采集系統購自日本Nikon公司；Viewfinder3.0成像軟件購自日本Olympus公司。

1．1．3 注射用反義寡核苷酸

顯微注射用反義寡核苷酸morpholino oligosATG，SCON為Gene Tools公司合成，ATG為與金魚Vsxl基因的mRNA序列中1～24堿基序列互補的一段序列；SCON為standard control即標準對照，為一段人類特有的還未發現與之互補的一段序列，注射前將300mmol/L的morpholinooligos溶于300μL滅菌水配成濃度為1nmol/lmorpholino oligos，分裝保存于-70℃冰箱中備用。

1．1．4 實驗動物

“紅帽子”品系金魚幼苗(Carassius auratus)購自長沙市花鳥市場，于金魚飼養場飼養至成熟。

1．2 實驗方法

1．2．1 受精卵的制備

將紅帽雄性金魚的精液擠入裝有少量曝氣水的培養皿中，同時擠入同品系的雌性金魚卵子，使之受精，得到自交二倍體受精卵，每次控制受精卵數目約200個。

1．2．2 金魚受精卵的顯微注射

1．2．2．1 受精卵去膜

受精卵受精后靜置3～5min，用胰酶去膜，約20min，期間觀察吸掉未受精的卵子，剝膜后，將受精卵轉入裝有曝氣水的培養皿中洗2～3次，洗去黏附的胰酶，吸20個左右受精卵放人10倍高滲液中，然后轉入盛有5倍高滲液的小皿中準備注射。

1．2．2．2 顯微注射

將注射針調至約30°～45°，將受精卵逐個注射ATG，或者注射滅菌水和SCON，注射時迅速刺人受精卵動物極，注入試劑時有鼓動，圖1為顯微注射示意圖。

1．2．3 注射受精卵的培養

注射好的受精卵，移入有瓊脂底板的培養皿中培養，培養液是加入青霉素和鏈霉素的隔夜冷開水，次日可只用過濾了的曝氣水培養，培養期間，在體視鏡下觀察，再次挑出未受精的卵子和由于注射機械損傷導致破碎的胚胎，每隔3h換一次培養水，并不斷觀察已注射胚胎和未注射胚胎的發育狀況。

1．2．4 注射受精卵的統計

當金魚胚胎發育到原腸早期時剔除發育不下去的胚胎或死亡的胚胎，或注射ATG未起到抑制作用而發育正常的胚胎，分別統計計數。

2 結果與分析

2．1 受精卵質量對胚胎發育的影響

受精卵的質量主要由精子和卵子的質量決定，與產卵時間和受精溫度相關，我們觀察到早上和上午產的卵子質量較下午好，在體視鏡下可以觀察到上午受精卵均勻透亮，下午的卵子可見少許顆粒，分布不是很均勻，經過顯微注射的受精卵這種差異尤其明顯，不同質量的受精卵顯微注射的結果見表1，在觀察統計2006年近半個月時間的注射情況(從4月2號至4月18日)，在其它條件一致的情況下，9:20～10:20的受精卵質量較17:00以后的受精卵好，經注射滅菌水后培養結果更可看出，上午受精卵注射后死亡率為13.9％，顯著低于下午受精卵注射后的死亡率41.0％(Z=-16.131，P=0.000)，這主要是金魚產卵的最佳溫度約20℃，而金魚在3月底至4月底大概有一個月的產卵期，不過到每天下午或金魚產卵后期，可能因氣溫相對較高，卵子質量差，注射的受精卵死亡率高，因此應選擇上午的受精卵做注射實驗，并使溫度控制在20℃左右。

2．2 去膜胰酶濃度對胚胎發育的影響

在其它條件一致的情況下，通過比較不同濃度的去膜效果，發現濃度為0。4％的胰酶比較合適，大約15min可以去膜；濃度低于0.4％的胰酶消化受精卵的膜較困難，需要半小時甚至更久才能去膜，影響單細胞期及時注射，另外，消化時間過久，也會導致胚胎消化過度，卵透明帶蓬松，活力下降，降低注射后卵的成活率，而濃度高于0.4％的胰酶容易消化過度，胚胎細胞呈不規則形，影響受精卵的發育。

2．3 注射劑量對胚胎發育的影響

如表2所示，隨著注射劑量的增加，在原腸早期，注射了ATG的胚胎不能繼續發育的比例和注射了滅菌H₂0和SCON的胚胎的死亡率基本呈增加的趨勢，但注射4.6nmol/L、6.9nmol/L、9.2nmol/L兩兩比較P＞0，05，無顯著差異，因此注射的體積不必過大，注射ATG在4.6～9.2 nmol/L都有較明顯的抑制效果，從圖2中可看出大部分胚胎不能繼續發育，注射4.6nL ATG的胚胎有70.6％的高比率不能繼續發育，這可能是由于ATG的作用導致Vsxl表達受阻，已達較好的注射效果；注射滅菌H₂O和SCON的胚胎死亡率顯著低于注射ATG(P＜0.05)，說明注射的機械損傷和毒性作用相對比較小，因此，實驗在保證注射效果的前提下，盡量選擇低劑量，以減少毒性作用，本實驗選擇注射的最佳劑量為4.6nL。

2．4 注射技術的影響

顯微注射的影響因素除動物的種屬、受精卵的質量、注射基因濃度、劑量外，還包括技能的熟練與否等其它因素，注射針的質量也是顯微注射成敗的關鍵之一，若太粗，針頭碰觸受精卵易滾動，不好準確刺人，且受精卵受傷較大；若太細，易堵塞針孔，理想的注射針針尖開口應小于1μm，尖部長度適宜(50～80μm)，注射時，使注射針停留2～3。后迅速抽出注射針，可保證注射物全部注入且不回流，若即刻抽出注射針易帶出注射物或胞質，影響注射效果，注射的時期和部位也是影響注射效果的因素之一，梁利群等認為外源基因導入受精卵的最佳時期應選在單細胞后期，因魚的受精卵發育較快，本實驗顯微注射時間在單細胞期至二細胞期，注射部位為動物極，另外，我們還觀察到，注射前將去膜受精卵放人10倍濃度的Half’s液中約30s，可使細胞膜張力增大，注射后膜破少，卵子萎縮，以便注射，再轉入加有5倍濃度的Half’s液的小皿中注射，便于傷口愈合，愈合后，不流細胞質。

3 結論

受精卵的質量好壞是影響顯微注射存活率的重要因素之一，同一條雌性金魚的卵子的質量也會隨著產卵時間的推遲，或是環境溫度的變化有所改變，一般早上和上午的卵子較下午和晚上的好，以20℃為基準，溫度大約20℃的卵子較25℃以上的卵子質量好，因此，在早上和上午選擇質量較好的受精卵，用0.4％的胰酶去膜，注射劑量為4.6nL，熟練的顯微注射技能，可提高受精卵反義寡核苷酸顯微注射的成功率，為基因功能研究提供材料保障，利用顯微注射法導人外源基因或者反義DNA是研究基因功能的有效途徑，以上結果可為顯微注射法的應用提供有益的借鑒。

作者簡介：喻小燕(1973—)，女，湖南寧鄉人，湖南信息職業技術學院講師，湖南師范大學生命科學院碩士研究生，主要從事蛋白質化學與蛋白質組學研究；梁宋平(1946—)，男，湖南安化人，湖南師范大學教授，博士生導師，通訊作者，主要從事蜘蛛毒素與蛋白質組學研究。