Ｉ－超家族芋螺毒素研究進展

摘 要：I-超家族芋螺毒素是芋螺毒素中較復雜的超家族之一，它可分為I₁和I₂兩組，通常由33～46個氨基酸所組成，具有相同的4對半胱氨酸骨架，可特異性作用于各種離子通道及受體，現對該芋螺毒素的生物化學及分子生物學特征、生理學活性、結構與功能的關系及應用前景等方面的研究進行綜述，

關鍵詞：I-超家族芋螺毒素；離子通道；二硫鍵；翻譯后修飾

中圖分類號：Q516；Q71；R996.3 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0283-06

芋螺(conus)屬于腹足綱軟體動物，棲息在熱帶海洋的淺海水域，芋螺種類復雜，外殼花紋美麗，因外形呈圓錐形或芋頭狀而得名，目前全世界大約有500多種芋螺，按其食性不同可分為3類：食蟲性、食螺性和食魚性。其中食蟲性芋螺最為多見，大多以捕食多毛目環節動物為主，有些則捕食半索海生動物及螠蟲；其次是食螺性芋螺，能捕食其他腹足動物；最被注目的是食魚性芋螺，因其毒性對人和哺乳類動物危害較大。

芋螺毒素(conotoxin，CTX)是芋螺分泌出來的用于捕食和防御的武器，能特異性作用于各種離子通道及神經遞質受體，從結構上看，芋螺毒素通常是由10～46個氨基酸殘基組成的活性多肽小分子，結構多樣，富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架，芋螺毒素生物活性強，作用靶位廣且具有高度選擇性，可直接用作藥物，又可以作為設計新藥的先導化合物，具有重要的理論和應用價值，因而受到全世界科學家們的廣泛關注。

芋螺毒素種類繁多，成分復雜多樣，按含二硫鍵對數的多少大致分為非富含二硫鍵芋螺毒素和富含二硫鍵芋螺毒素兩大類(表1)，非富含二硫鍵芋螺毒素指不含二硫鍵或只含單個二硫鍵的多肽毒素，如芋螺遲緩肽(contulakin)、芋螺睡眠肽(conantokin)、芋螺升壓肽(conopressin)等，富含二硫鍵芋螺毒素指含有兩對或兩對二硫鍵以上的多肽毒素，芋螺毒素按每個成員高度保守的信號肽序列及其作用靶位又可分為若干個超家族和家族(表1)，其中I-超家族芋螺毒素種類較為復雜，相異也大，由于信號肽序列的不同，又可分為I₁、I₂兩組，相對其它超家族而言，I-超家族芋螺毒素的研究才剛起步，大多只停留于對一級結構的表征描述，對其高級結構和生理學功能方面涉及不多。

1 I-超家族芋螺毒素的分類、生物化學及分子生物學特征

I-超家族芋螺毒素相對于其它芋螺毒素發現較晚，于2003年由3家實驗室同時報道，它們含量豐富，分布廣泛，在食蟲性、食螺性和食魚性芋螺中都有發現，目前已發現了幾十個I-超家族芋螺毒素(I-CTX)，該家族毒素比一般的芋螺毒素要大，并且成熟肽超變異，I-超家族芋螺毒素通常由33～46個氨基酸組成，含有4對二硫鍵，分子生物學研究發現，每個芋螺毒素均有單一的mRNA編碼，原始翻譯產物是它們的蛋白前體，前體通常由N-端的信號肽，中間的Pro區和C-端的成熟肽組成，Buczek等對I-超家族芋螺毒素的cDNA序列分析發現其家族成員之間的信號肽序列同源性很低，按信號肽序列可將之分為I₁和I₂，兩組(表2)，第1組

I₁-超家族芋螺毒素可視有無翻譯后修飾分為A、B兩類，其中A類芋螺毒素的C，末端倒數第3個氨基酸一般為Phe、Leu或Met，都是D型氨基酸，B類芋螺毒素的信號肽和pro區與A類的較為相似，但其成熟肽的長度比A類的短，而且沒有翻譯后修飾，第2組I₂-超家族芋螺毒素沒有pro區，而在其前體的C-端有一段約6～13個氨基酸的序列，被稱作postpeptide(表2)。

值得指出的是：在已知的postpeptide序列中(K-BtX是唯一蛋白質與基因序列都被闡明的，其余主要是從eDNA序列推測而來)，其N-端都有保守的GKR序列，根據K-BtX蛋白序列測定結果，很可能在postpeptide中保守的雙堿性殘基KR的肽鍵上先被類furin酶所裂解，再被carboxypeptidase B將兩堿性殘基移去，而剩下的Gly則被用作毒素N-末端殘基的酰胺化，如K-BtX的C-末端殘基的Pro被酰胺化，Postpeptide的作用不清楚，有可能是作為毒素翻譯后修飾的信號序列，或在毒素的多肽折疊中起作用，最近我們實驗室又從唐草芋螺(C.caracteristicus)中分離了幾種新型毒素，它們具有I-超家族芋螺毒素的半胱氨酸骨架，但其信號肽與I₁和I₁，毒素都不同，也許屬于I-超家族的另一個家族分支，從以上分類可看出，I-超家族芋螺毒素是十分趨異的。隨著更多家族成員的發現，也許會對該超家族提出新的分類原則。

芋螺毒素是迄今為止所發現的翻譯后加工最為復雜的一類生物多肽，成熟肽的高度翻譯后修飾是芋螺毒素多樣性的一個重要途徑，蛋白前體中有被翻譯后修飾酶類識別的特殊信號序列，經過修飾后可生成有高活性的成熟肽，其中I-超家族芋螺毒素中最常見的加工方式是C-末端的酰胺化、脯氨酸的羥基化及谷氨酸的r羧基化，另一種翻譯后修飾方式是L-氨基酸的異構化，如將苯丙氨酸或亮氨酸轉換成D-型，可以提高其對某類亞型受體的特異性，其它芋螺毒素還發現有色氨酸溴代及絲氨酸或蘇氨酸糖基化的修飾等(表3)。

芋螺毒素分子的翻譯后修飾的重要作用在于可使單一基因衍生為結構不同的多種肽分子，即生成不同于母體分子的新的肽分子模體，從而大大增加了芋螺毒素分子的多樣性，并且提高了其對靶位分子的識別能力與專一性，同時這些結構變化也常能提高芋螺毒素對蛋白酶的抗性，翻譯后的修飾也往往與芋螺毒素的功能活性密切相關。

這些氨基酸的修飾與加工均需要特定的酶，同時也需要相應的識別序列或者特征結構，I₁組中A類的I-CTX，其序列中有一對D-型異構偏愛的位點(表2)，在此位點上氨基酸能發生D-型異構修飾，這與氨基酸的種類無關，已知的研究結果表明，N-末端順數第2個氨基酸及C，末端倒數第2或第3個氨基酸往往是D-型異構的偏愛位點，如蜘蛛毒素to-agatoxin TK，它雖與芋螺毒素rlla序列同源性低，發生D-型異構修飾的氨基酸也不同(前者為Ser，后者為Phe)，但其所處位置相同，均處于C-末端倒數第3位，這些修飾酶的作用機理、識別序列及其選擇性加工的分子機制還不清楚，亟待進一步研究，

2 I-超家族芋螺毒素的生理學活性及結構與功能關系

對I-超家族芋螺毒素的結構、功能及生理學活性等方面的研究才剛起步，目前I₂組中的兩個毒素(ViTx和K-BtX)其生理學活性得到了較清晰的闡明，確定了它們的分子靶點，對于其它毒素如I₁組中的rlla、r11b和r11c等也作了一定的生理學活性的探索，其中對于r11a(另命名L-RXIA)，最近已確定了其分子靶點。

K-BtX是目前多肽類毒素中唯一的一個鉀離子通道激活劑，并且選擇性地作用于鈣激活的、電壓門控的BK通道，K-BtX的成熟肽含31個氨基酸殘基，其前體肽的C-端有一段13個氨基酸的序列(GKRSKLQEFFRQR)，在翻譯后加工中被蛋白酶移去。K-BtX經翻譯后修飾，3個谷氨酸全被羧基化，27位脯氨酸被羥基化，31位脯氨酸被酰胺化(表3)，全細胞膜片鉗實驗表明K-BtX對鈉離子、鈣離子通道無作用，只作用于BK鉀通道，對鉀離子通道的其它亞型如SK通道幾乎不作用，K-BtX最大的特點在于它是鉀離子通道的激活劑，而以往所發現的作用于鉀離子通道的毒素都是阻斷劑或拮抗劑，如k-PVIIA是第一個被發現的作用于鉀離子通道的芋螺毒素，能以高親和力阻斷shaker鉀離子通道，k-BtX毒素并不影響單通道的電流／電導，但可增加通道的開放概率及整體開放時間，從而表現出激活活性，目前還不清楚x-BtX與BK通道的具體結合位點，根據已知的研究結果可推測：1)它可能結合在BK通道的胞外；2)它與鉀離子通道的結合位點可能不同于蝎毒毒素的charybdotoxin；3)其結合位點不可能在BK通道的J6C亞基上。

1997年，Dauplais等人在綜合比較了海葵鉀通道毒素和蝎鉀通道毒素的重要功能殘基后提出功能對的假說叫2002年，Srinivasan等人對功能對假說進行了修改，將它的適用范圍進行了一定的約束，修改后的假說認為：作用于電壓門控鉀通道(Kv)的動物毒素，都含有LYs-Tyr/Phe所組成的功能對，LYs和TTr/Phe的距離符合6.0±1.0A，并且功能對是毒素與通道結合中最重要的功能殘基，芋螺毒素K-PVIIA就是通過一個保守的功能對(LYsT-Phe9)而與鉀離子通道結合的。

同屬于I₂組的ViTx其成熟肽含35個氨基酸殘基，膜片鉗實驗表明該毒素可抑制哺乳動物鉀離子通道Kv1.1和Kv1.3，但對Kv1.2卻無抑制活性，雖然ViTx對鉀離子通道有很強的選擇性和特異性，但相對其它毒素而言其親和力卻不強，這種低親和力也許暗示ViTx可能有特殊的結構特征，也有可能尚未找到與ViTx有更強親和力的分子靶點。

Mondal等根據同源建模得到了ViTx的理論三維結構，在與K-PVIIA比較后，他們認為ViTx的Lvs35不可能參與通道的結合，而Arg26極可能在通道結合中起關鍵作用，他們用原位錨定(in silico docking)研究了ViTx與Kv1.1的相互作用，發現Lvs35遠離通道的孔區，Arg2也遠離孔區，而Arg26和Arg32靠近孔區，也許Vi7x就是靠帶正電荷的殘基而錨定于鉀離子通道的孔區，這樣ViTx像一個蓋子一樣蓋住了通道，從而起到了阻斷作用，這種阻斷機制與KM-RIIIA及Tshal鉀離子通道的作用機制十分相似，而不同于K-PVIIA，后者通過一個保守的功能對(LysT，Phe9)與鉀離子通道結合。

Jimenez等從食魚芋螺C.radiatus中分離純化出5個I-超家族芋螺毒素，并且用基因克隆手段從該螺中得到十幾個I-超家族成員，動物實驗表明當其注入小鼠體內時會引發興奮癥狀，他們還進一步研究了I₁組中屬于A類的r11a、r11b、r11c和rlle的電生理活性，發現它們作用于周質軸突，引發重復性動作電位，表現為興奮活性，因此這幾個毒素的分子靶點可能參與調控軸突的膜興奮性。

在最近的一篇報道中，Buczek等發現rall作用于鈉離子通道，并且解析得到了其三級結構，r11a具有抑制劑半胱氨酸繩結模體(inhibitorcysteine knot motif，ICK motif)的結構，這個motif由3對二硫鍵(Cys5-Cysl9、Cysl2-Cys22及Cysl8-Cys27)穩定，第4對二硫鍵(Cys21-Cys38)將ICK motif與C，端連接起來。

r11a、r11b和r11c中都有D-型氨基酸，而且氨基酸的異構現象對芋螺毒素的功能活性有很大影響，對r11c而言，r11c LL-Leu42]和r11C[D-Leu42]在神經細胞和肌肉細胞上均可引發重復性動作電位，而r11a和r11b的D-Phe44轉變為L-Phe44后就無此活性，此外r11a和，11b只在神經細胞中引發重復性動作電位，再由突觸將之傳給肌肉細胞，而r11c可直接在肌肉細胞上引發重復性動作電位，序列同源性比較，發現rlla和r11b之間的同源性高，因此功能相似，而rllc卻與兩者的同源性低(表2)。

Aguilar等從食蟲芋螺C，spurius中純化得到一個32個氨基酸的I-超家族芋螺毒素srlla。序列同源性分析發現其與K-BtX之間的同源性高(51％)，而與Vi7x同源性較低(31％)，因此推斷srlla可能作用于BK通道，而不作用于Kv1.1和Kv1.3，動物實驗也表明srlla會引起小鼠身體僵直、豎尾等癥狀，這種現象與x-BtX具有激活性是相符的，但是。srlla的具體分子靶點還需通過進一步的電生理實驗才能確定。

Kauferstein等對11種芋螺的粗毒液進行電生理實驗。發現3種芋螺的毒液對Kv1.1和Kv1.3有阻斷活性，而對Kv1.2卻無作用活性，這說明其中很可能存在與ViTx功能相似的多肽，根據基因克隆結果從螺中得到了其cDNA序列，由之推斷得到氨基酸序列，發現它們與ViTx同源性極高，其中兩個來自C.vexillum的毒素多肽與ViTx各僅有一個氨基酸的差異(表2)。

總之，對I-超家族芋螺毒素的活性研究才剛起步，目前只有ViTx、x-BtX以及rlla確定了它們的分子靶點，前兩者雖都作用于鉀離子通道，卻有完全相反的功能，ViTx是鉀離子通道的阻斷劑，K-BtX卻是激活劑，ViTx和K-BtX具有相似的信號肽序列，同屬于I₂組，但卻功能差異大，也許這與其序列多樣性有關，屬于I₁組中的rlla作用于鈉離子通道，是鈉離子通道拮抗劑，I₁和I₂兩家族成員有不同的信號肽序列，并且在成熟肽序列上更加趨異，半胱氨酸環間的氨基酸數目差異也大，也許這暗示兩家族成員完全不同的生理功能。

3 I-超家族芋螺毒素的應用前景

I-超家族芋螺毒素分布廣，種類繁多，生物活性強，從目前的研究結果來看，I-超家族芋螺毒素多為興奮肽，其中一些已確定了其分子靶點(如ViTx和K-BtX)，它們對鉀離子通道有高度選擇性和親和性，可以作為研究鉀離子通道極好的探針，可能成為神經科學研究的重要工具，因而具有良好的研究價值和廣闊的應用前景，從C.radiatus中發現了十幾個可誘發軸突興奮性的I-超家族毒素，這無疑對了解及研究周質軸突的分子多樣性提供了有力的工具，可鑒定介導軸突興奮性的分子，從而闡明其分子作用機制，由于每種多肽毒素都會與其特異的靶分子結合，而從同一種芋螺中能得到多種同一超家族的相關多肽毒素，這說明它們很可能作用于一群功能和或結構彼此關聯的離子通道或受體的不同亞基，各家族成員在功能上互為補充，起協同作用。

由于芋螺毒素在生物化學及藥理學特征上的多樣性，常用于鑒定離子通道或受體的亞型及變異體，如ω-芋螺毒素已成為鑒定突觸前鈣離子通道的探針，α-芋螺毒素用于鑒定nAChR受體的各種亞型，鉀離子通道是最復雜的一種離子通道，在心臟速率的調節、肌肉的收縮、神經遞質的釋放等諸多生理過程中起著至關重要的作用，與作用于鈉離子通道和鈣離子通道的芋螺毒素相比較，目前能夠作用于鉀離子通道的芋螺毒素不多，僅有k-(O-超家族)、KA-(A-超家族)、KM-(M-超家族)及I-等4種超家族的芋螺毒素作用于鉀離子通道，I-超家族芋螺毒素成員復雜，序列趨異，為研究鉀離子通道提供了豐富的材料，可作為探針用于分離和鑒別鉀離子通道各種亞型，以及用于測定通道的生理、藥理、生化、生物物理及結構特征，從而闡明各種鉀離子通道亞型在生理過程中的重要作用。

芋螺毒素有著各自特定的藥理學作用范圍和生物學活性，因而具有重要的理論和應用價值，深入研究芋螺毒素，不僅對海洋制藥工業具有重要意義，也將為我國芋螺海洋資源的開發利用提供重要理論依據，由于它們對靶分子作用的高度選擇性及結構多樣性，有望可直接開發成藥物或成為新藥的先導化合物，K-BtX是第一個被發現的天然多肽鉀離子通道開放劑，相對其他作用于鉀離子通道的毒素而言，其對通道具有更高的特異性和選擇性，因此可作為研究鉀離子通道的有效工具，除K-BtX外目前還有其它4種可激活BK鉀通道的試劑，分別為：藥草、抗發炎芳香復合物、苯并咪唑和根皮素，它們的選擇性不強，效力不高，而且水溶性差，給藥不便，而K-BtX作用于通道的胞外區，無須穿膜，便于給藥，則可用于治療由于細胞膜超興奮引起的綜合癥。

總之，目前對I-超家族芋螺毒素的研究才剛起步，目前的工作僅集中于毒素的分離純化及其分子生物學表征方面的研究，而對其結構與生理功能的了解還很少，相信對芋螺毒素的深入研究，將會發現更多的家族成員，最近我們已發現其它新的I-超家族成員，其信號肽序列不同于以往已知的，對毒素高級結構的解析將有助于其生理學及分子作用機制的闡明，而對其生理活性的研究將有助于鑒別更多的鉀離子通道亞型，甚至發現其它的新靶點，從而為研究離子通道提供有力的工具。

作者簡介：黃麗君(1982—)，女，湖北荊州人，碩士研究生，主要從事多肽毒素研究；王春光(1976—)，女，黑龍江佳木斯人，同濟大學生命科學與技術學院教授，主要從事蛋白質研究，戚正武(1932—)，男，浙江寧波人，中科院上海生命科學研究院生化細胞所研究員，同濟大學蛋白質研究所所長及化學系主任，中國科學院院士，第三世界科學院院士，從事活性多肽及酶蛋白結構與功能的研究。