利用實時熒光定量ＰＣＲ法檢測轉基因水稻外源基因拷貝數的研究

摘 要：轉基因植物中外源基因拷貝數是影響目的基因表達水平和遺傳穩定性的重要因素，因此外源基因拷貝數的檢測成為轉基因研究的關鍵，利用高通量、快速、靈敏的SYBR Grcen I熒光定量實時PCR法，檢測了轉大麥煙酰胺合成酶基因(NAS1)水稻中外源基因拷貝數，以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作為水稻的內源參照基因，通過梯度稀釋法，分別獲得了NA51和SPS基因的Ct值與起始模板數的相關性標準曲線，相關系數分別為0.99976和0.99571，相關性高，通過目的基因NASl和水稻內源參照基因SPS起始模板數的比較，獲得了目的基因在轉基因水稻中的拷貝數，在8株轉基因株系中，1株為假陽性，1株拷貝數為1，3株拷貝數為2，其余3株拷貝數分別為3、4和7，而陰性對照拷貝數為0，這種方法快速、簡便、準確，可以滿足轉基因育種工作中對后代優良株系的選擇。

關鍵詞：SYBR Creen I實時熒光定量PCR；煙酰胺合成酶基因；轉基因水稻；拷貝數

中圖分類號：Q503 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0301-05

植物遺傳轉化是作物改良和新基因功能鑒定的常用方法，但在轉基因植物中外源基因拷貝數常影響目的基因的表達水平和遺傳穩定性，因此，轉基因研究中關鍵的一步就是檢測外源基因的拷貝數，以篩選出拷貝數少或單拷貝的轉基因植株供進一步的研究或育種利用，傳統的轉基因植株拷貝數檢測主要是Southern雜交法，但該方法工作量大，需要的DNA材料較多，費時費力，并且經常要用到放射性同位素等具有潛在危險的藥品，近年來，利用高通量、快速、靈敏的定量PCR方法檢測轉基因拷貝數逐漸受到科研人員的青睞。

SYBR Green I實時熒光定量PCR法是在PCR反應體系中加入SYBR Green I熒光染料，該染料能夠結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域并具有受激發產生綠色熒光的能力，當它與PCR合成的雙鏈DNA結合，在激發光照射下產生熒光，由于熒光信號強度的增加與PCR產物的增加完全同步，因此通過對PCR反應進程中的熒光信號強度進行實時檢測，就可間接的獲得PCR擴增數據，根據Ct(cycle thresholds)值與起始模板數的對數值成反比線性關系的原理，制作標準曲線，獲得Ct值與起始模板數的相關性方程，將樣品的Ct值代人該方程就可獲得目的基因的起始模板數，通過與水稻內源參照基因起始模板數的比較，就可知道基因組中該外源基因拷貝數，內源參照基因一般選擇拷貝數少，同一物種內的不同生態類型間具有穩定的序列結構和拷貝數的一類基因，Ding等通過對水稻、小麥、玉米、大麥等十幾種作物的研究發現，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)基因是水稻特有的基因，并且為單拷貝，可以作為水稻的內源參照基因。

本研究利用根癌農桿菌介導法獲得的轉大麥煙酰胺合成酶基因(NAs1)的水稻為材料，選擇蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作為內源參照基因進行拷貝數估算，通過SYBR Green I實時熒光定量PCR法檢測轉基因植株中NASl基因的拷貝數。

1 材料與方法

1．1 材料

水稻材料：非轉基因水稻臺北309；轉NAS1基因的臺北309當代植株。

質粒載體：p0390-MF-NASl，中科院遺傳所儲成才研究員協議提供，含有NAS1基因，編碼產物為煙酰胺合成酶。

試劑：大連寶生物工程有限公司生產的SYBR Premix Ex Taq^TMM(Code N0：DRR041S)。

1．2 方法

1．2 1 DNA的提取 水稻基因組DNA采用SDS法提取，用BioPhotometer分光光度計(Eppendorf公司)檢測DNA含量及純度。

1．2．2 引物

NAS1基因引物用primer express設計，SPS基因引物參照楊立桃等文中序列(見表1)，均由上海生物工程有限公司合成，退火溫度為60℃。

1．2．3 PCR反應體系和程序

定量PCR反應體系：SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)10μL，PCR上游引物(10μmol/L)0.4μL，PCR下游引物(10μmol/L)0.4μL，DNA模板(1.5mg／L)2.0μL，滅菌蒸餾水7.2μL，總體積20μL。

PCR反應程序為(本實驗采用兩步法PCR擴增程序)：預變性，95℃10s，循環數1；PCR反應，第一步，95℃變性10s；第二步，60℃退火延伸45s，同時在退火過程中檢測熒光信號變化，共進行45個循環，熒光定量PCR儀為Rotor-gene3000 Real Time Thcmlal Cycler(Corbett Research，Australia)。

1．2．4 NAsl基因和SPS基因標準曲線的制作

本實驗中DNA濃度的測定采用BioPhotometer分光光度計(Eppendorf)，定量PCR結果采用軟件Rotor-gene-6-0-19分析。

NAsl基因標準曲線的制作是將帶有目的基因的質粒DNA做10、102、103、104倍稀釋，并以這些稀釋的DNA為模板進行PCR反應，得到各自的Ct，通過Ct值與起始模板數的對數值之間存在的線性關系，獲得標準曲線，SPS基因標準曲線的制作是將水稻基因組DNA做10、 10×2、10²、10²×2、10³的梯度稀釋，用與NAS1同樣的方法獲得標準曲線。

2 結果與分析

2．1 標準曲線的制作

NAsl和SPS基因的擴增曲線如圖1和圖2所示，標準曲線如圖3和圖4所示，NAsl標準曲線的相關系數及=0.99976，相關性高，該基因Ct值與起始模板數(NA3信)之間的相關性方程為：NAS₀=10^(-0.279Ct)；SPS基因標準曲線的相關系數為R=0.99571，相關性高，該基因Ct值與起始模板數(SPS₀)之間的相關性方程為：SPS₀=10^{(-0.286Ct+12.668)。}

2．2 熔解曲線分析

采用SYBR Green I熒光嵌合法檢測時，由于SYBR Green I可以嵌合進所有的雙鏈DNA的小溝區域，受激發而發出熒光，因此必需做PCR反應的特異性檢測，一般通過熔解曲線來分析其擴增特異性，理想的熔解曲線應該是單峰型曲線，如果出現兩個或兩個以上的峰，說明有引物二聚體等非特異性擴增產生，在本實驗中，通過對NAsl和SPS這兩個基因的熔解曲線分析(圖5、圖6)可以看出，這兩個基因的熔解曲線都是單峰型，說明在PCR擴增過程中，沒有出現非特異性擴增，由此推斷定量PCR擴增所獲得的數據是可靠的。

2．3 NASl和SPS基因起始模板數的計算

在本實驗中，選取8株PCR檢測為陽性的植株和1株非轉基因對照植株，利用SDS法提取基因組DNA，每個樣品做3個重復，進行定量PCR反應，獲得擴增曲線，熒光域值的設定與制作基因標準曲線時相同，獲得待測樣品的CC值(表2)，并由方程：NAS₀=10^{(-0.279Ct+12.3315)}計算出該樣品NAS1基因的起始模板數，由方程：SPS₀=10^{(-0.286Ct+12.668)}計算出該樣品SPS基因的起始模板數，由于水稻內參基因SPS是純合二倍體，而轉基因當代的外源目的基因是純合體的幾率極小，因此NAS1起始模板數除以SPS起始模板數所獲得的數據，乘以2就是目的基因在水稻基因組中的拷貝數(表3)，通過目的基因NASl和水稻內源參照基因SPS起始模板數的比較，結果顯示：陰性對照為0.038+0.000，確定陰性對照目的基因拷貝數為0，株系T-43為0.478±0.016，可判定為非轉基因植株，其余有1個株系拷貝數為1，3個株系拷貝數為2，拷貝數為3、4、7的分別只有1個(表3)。

3 討論

Southern雜交作為一種傳統的外源基因檢測法，其準確性已經得到了大家的普遍認可，而定量PCR是一種新近發展的技術，它通過擴增產物估算起始拷貝數，具有靈敏、快速、高通量等優點，但PCR反應過程中起始模板數微小的差異或是反應效率的微小變化都將使結果產生較大幅度的偏差，這就需要在實驗中設置多個重復盡量減少誤差，通過近年來定量PCR和Southern雜交方法的相互比較驗證，發現用定量PCR法和Southern雜交法檢測轉基因拷貝數的結果十分接近，因此定量PCR也是一種有效的轉基因拷貝數分析方法。

在利用這兩種方法檢測轉基因拷貝數時常發現有小部分結果不一致，主要表現為用定量PCR法檢測的轉基因外源拷貝數常多于Southern雜交法檢測結果，如Ingham等在檢測轉基因玉米外源基因拷貝數時發現，有兩個樣品在定量PCR檢測結果是2個拷貝數，而在Southern雜交檢測結果卻只有一條帶，楊立桃等同樣發現有3株定量PCR法檢測的拷貝數高于Southern雜交，這種不一致可能是由多種原因造成的，比如Southern雜交法采用酶切，電泳的方法，在同一個插入位點有多拷貝的T-DNA片段插入時，轉基因植株的基因組在完全酶切時會產生相似的DNA片段，在電泳時難以分辨清楚，導致Southern雜交分析結果產生偏差，同時基因重排、消化不完全、顯影時本底高低以及膠片上條帶的主觀判斷等都可能造成對拷貝數的錯誤估計，而在定量PCR中，只有基因重排會影響拷貝數的檢測結果，理論上來說，實時PCR所檢測出的拷貝數可能更接近于客觀事實，因此，對于在育種工作中篩選低拷貝或者單拷貝的轉基因株系來說，定量PCR法所提供的準確度足以滿足育種工作需求，同時還簡單、方便，隨著該技術的普及和發展，檢測成本也會逐漸降低。

作者簡介：王育花(1979—)，女，陜西乾縣人，碩士研究生，主要從事作物耐逆境抗旱育種及其分子機理的研究；肖國櫻(1965—)，男，湖南安化人，研究員，博士，通訊作者，主要從事作物耐逆境抗旱育種及其分子機理的研究。