羊草分子生物學研究進展

摘 要：羊草是一種優質牧草。對發展我國優質草地畜牧業具有重要意義，以往研究對羊草生物學以及生理生態學進行了比較深入的探討，但對于羊草分子生物學的研究起步較晚，進展也比較緩慢，近年來，隨著分子生物學研究手段和技術的進步，以及羊草遺傳改良的需要，人們在羊草遺傳多樣性、愈傷組織培養、酶蛋白分析以及基因克隆與轉化等研究領域陸續開展了一些有益的嘗試，并取得了重要的研究成果，結合科研工作的需要，對羊草分子生物學的最新進展進行了概述，并就亟需解決的問題進行了分析，提出了該領域今后的發展方向。

關鍵詞：羊草；分子生物學；遺傳多樣性；組織培養；基因克隆

中圖分類號：S543.901 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0289-06

羊草(Leymus chinensis)是多年生禾本科賴草屬草本植物，由于其環境適應性較強。具有耐寒、耐旱、耐鹽堿等優點而成為松嫩平原的優勢物種，同時羊草也是一種重要的牧草資源，蛋白質含量高，適口性好，耐踐踏，在發展草原畜牧業方面具有重大的經濟和社會效益，但羊草種子發芽率低、種子萌發最適pH值為8.0～8.5，加上過變放牧和草地鹽堿化日益加重等原因，我國現存系統管理重點實驗室項目(K09M6)羊草草地約有90％以上發生了不同程度的退化，因此，研究羊草的遺傳分化、抗逆機理、栽培育種以及轉基因等對于改善生態環境和草場建設具有重要意義，隨著分子生物學對各個學科的交叉滲透，使羊草的研究從細胞水平進一步深入到分子水平，羊草屬于異交植物，物種趨向于在種群中具有較高水平的變異性，僅在松嫩草原中西部靠近內蒙古高原東部草原上的羊草種群就數以千計，這為研究羊草種群的遺傳多樣性提供了對象，培養愈傷組織是進行羊草轉基因研究的前期工作，但誘導率低的問題尚未得到解決，筆者結合自己的科研工作，對羊草分子生物學領域的研究成果加以綜述，旨為羊草抗逆分子機理研究提供參考資料。

1 羊草遺傳多樣性研究

由于羊草生態適應性強、分布范圍廣、生境類型多樣，在長期的適應和進化過程中，羊草種群之間在形態、生理、生態以及遺傳特征方面均產生了趨異，RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態DNA)技術可以在對被檢對象無任何分子生物學資料的情況下對其基因組進行分析，而且具有費用較低、方便易行、模板DNA用量少、不需要同位素，在安全性和實驗操作上具有比AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增酶切片段多態性)、SSR(simple sequence rc-peat，微衛星重復序列)等分子標記更加簡便易行等優點，從而使其成為目前研究羊草遺傳多樣性的最重要的手段之一，該技術主要是利用各種群羊草的總基因組DNA作為模版，篩選能夠擴增出具有明顯差異性條帶的隨機引物，以至少兩次重復均出現的結果做0，1矩陣圖，即有條帶記為1，無條帶記為0，計算總片段數及多態位點百分率、各種群間遺傳相似系數和遺傳距離，利用分析軟件進行聚類分析從而得到其遺傳結構樹狀圖，

羊草RAPD分析可以用于研究羊草的種群關系以及遺傳分化的影響因子，崔繼哲等應用RAPD技術證明相似生境或同一地域的種群在一些位點上表現出相似或相同的變化，劉惠芬等運用RAPD技術對內蒙古典型草原不同生境8個羊草種群進行分析，聚類結果顯示生境相似的種群能夠聚在一起，而地理距離最近的種群不一定歸為一類，說明小范圍內羊草種群間的遺傳分化與地理距離不存在相關性，而與其生境間的相似度相關，影響遺傳相似性的不是單一因子而是各種因子的綜合作用，較小地理范圍內羊草種群間的遺傳分化主要是由環境的異質性所引起的，筆者曾以采自中國大安堿地生態試驗站(N45°36′，E123°53′)的羊草種子單株播種栽培，以每株羊草幼苗的地上部為材料進行RAPD分析，30個實驗樣品的平均遺傳距離為0.1909，共可分為4個類群(待發表)，通過RAPD分析，還可以進一步將羊草遺傳分化多樣性的原因具體化，汪恩華等””利用分子標記與形態標記以21個有效隨機引物中對9份羊草材料進行RAPD分析，對隨機抽取的17份禾草種質進行了種質評估的比較研究，結果表明，羊草種質的小穗數、種子千粒重、葉色、有性繁殖量和結實率5個形態學指標與遺傳多樣性指標存在一定的相關性，應用RAPD技術對不同生境羊草在水分脅迫下游離脯氨酸含量的變化做聚類圖比較分析，證實水分是影響羊草種群間遺傳變異和生態型分化的一個最主要的因子，雖然水因子是影響羊草分化的一個主導因子，但是在實際研究工作中也認識到羊草變異和分化是多種生態因子綜合起作用的結果(如溫度、海拔、經緯度、土壤類型等)，而且各因子之間又是相互影響，在不同的生境中限制因子又是變換的，這就造成不同地理種群的羊草遺傳分化過程的復雜性，由此可見，目前以羊草為實驗材料的RAPD分析雖有許多報道。但是由于羊草本身具有較高的種群變異性。組成羊草群落的植物總計有357種，加之尚缺乏一種統一的標準分型方法，因此RAPD技術就成為研究羊草分類及來源的主要工具，在物種鑒定及遺傳分化研究中發揮著重要作用。

除了RAPD技術以外，等位酶技術也可用于羊草遺傳多樣性分析，等位酶是指由一個位點的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同，崔繼哲等通過該技術，綜合分析了松嫩平原11個羊草種群的遺傳多樣性及遺傳分化指標，深入剖析了灰綠型和黃綠型兩種葉色類型羊草種群之間的遺傳差異，證明種群間的遺傳距離與地理距離之間沒有相關，崔繼哲等還采用淀粉凝膠電泳技術，應用等位酶分析方法測定了松嫩平原南部微生境下羊草灰綠色和黃綠色兩種生態型9個種群的遺傳多樣性和遺傳分化程度，證明羊草種、種群和生態型水平都維持較高的遺傳多樣性，兩種生態型之間有明顯的遺傳多樣性差異及遺傳分化，另外，對不同生境、不同分類種群的遺傳結構分析發現羊草種群遺傳變異度很高，但是無論如何歸屬，松嫩草原上的羊草種群遺傳分化程度很低，推測可能與羊草為異花授粉、不同類型混生及種群間基因流強度大有關，劉杰等曾用SSR作為探針構建了羊草的遺傳指紋圖譜，為羊草種質資源評價、種間及種內親源關系分析、生物多樣性研究提供了有效手段，利用AFLP方法對我國不同地區分布的羊草材料進行的DNA多態性分析結果也表明了羊草基因組DNA具有比較豐富的多態性。

2 羊草愈傷組織培養及利用

植物組織細胞培養(plant tissue and cell cul-ture)是通過運用植物組織細胞培養技術實現植物育種獲得新品種的一條快捷途徑，既可以通過花粉培養、未授粉子房以及胚株培養等誘導形成單倍體植物，也可以通過植物愈傷組織培養中普遍存在的染色體變異實現植物突變育種，另外，通過植物組織培養技術進行的植物細胞融合(尤其是原生質體融合)、胚胎培養以及植物體外受精技術可獲得遠緣雜交種，通過植物組織培養中的莖尖培養能夠產生無病毒原種，因而可用于植物脫毒，解決生產實踐中植物病毒危害問題，組織培養是植物細胞工程學、遺傳學、植物生理學、生物化學與分子生物學研究的重要基礎，不僅用于快速繁殖。還用于單倍體育種、種質保存、生理學研究和基因轉化等領域。

早在上世紀80年代，高天舜就利用羊草根莖作為外植體進行愈傷組織的誘導和植株再生材料，目的是為了改良羊草的遺傳性狀，試圖通過組織培養途徑獲得羊草新類型，該研究采用當年生羊草根莖幼嫩部分的節間基部切段以及隔年生老根莖和當年生根莖的芍間中部、頂部切段作為外植體，消毒處理后接種于3種MS培養基中，先進行暗培養。待長出愈傷組織后轉入光照培養，誘導率平均在20％左右，分化率最高也只有24.2％，羊草幼穗和成熟種子也可作為誘導愈傷組織的外植體，劉公社等，以幼穗作為外植體，恒溫25℃條件下誘導愈傷組織，在加有1mg/L2，4-D MS培養基上繼代2次后，轉移到含1.0mg/L KT和0.5mg/NAA的MS培養基上分化培養得到再生芽，并在無激素的基本培養基上獲得了生根的試管苗，移栽到溫室后可正常生長，盡管從羊草葉片、幼穗和成熟胚在同樣培養條件下均能誘導出愈傷組織，但只有幼穗愈傷組織能夠繼續分化出再生植株，但分化率因基因型和外源激素的不同而不同，以成熟羊草種子為外植體誘導愈傷組織具有操作簡便、污染程度低、材料選擇直觀化的優點，且誘導率和幼苗分化率較高、幼苗健壯、生長勢好，崔秋華等采用3種培養基(MS、B5和8114)，3種2，4-D的濃度水平(1、2、4 mg/L)培養羊草幼嫩根莖和種子，結果表明，以種子作為外植體可獲得較高的愈傷組織誘導率(29.05％)，但目前對于最適激素濃度沒有統一結論，其范圍從1～4mg/L不等，對愈傷組織的誘導效果也未達到令人滿意的水平，仍需要深入研究。

在對羊草愈傷組織的應用方面，可以以羊草種子誘導出的愈傷組織為材料，用含有NaCl的培養基和含有NaHCO₃與Na₂CO₃的混合鹽培養基進行培養，測定羊草愈傷組織的耐鹽性，結果表明羊草愈傷組織對NaCl最大耐受強度為180mmol/L；對NaHC03與Na₂CO₃的混合鹽的最大耐受強度為4mmol/L中性鹽(NaCl)與堿性鹽(NaHCO₃與Na₂CO₃)對羊草愈傷組織的脅迫機制明顯不同，國內外對于愈傷組織的培養大多應用于轉基因，但在羊草方面進行的該項研究卻很少，劉公社將攜帶PAT基因的質粒通過基因槍法轉化羊草愈傷組織。然后在篩選培養基上進行培養，篩選抗性愈傷組織并轉接到分化培養基上，得到再生苗，然后接種到含有篩選劑的生根培養基上培養后得到轉基因羊草小苗，該研究已獲得耐除草劑的羊草新品種專利，曲同寶等用基因槍將BADH基因轉入由羊草成熟胚誘導出的胚性愈傷組織中，獲得了轉基因植株，經過PCR檢測證明外源基因已整合到羊草基因組中并得以表達，雖然轉入羊草的基因都可被檢測到已整合人羊草基因組中，而且也得到表達，但是對于轉基因羊草對周圍生態環境的影響還未見相關報道，篩選突變體是羊草愈傷組織的另一用途，陳暉等用組織培養方法篩選獲得羊草抗羥脯氨酸(HYP)變異系HR20-8，該變異系細胞內游離氨基酸和蛋白質組分氨基酸含量均發生了較大的變化，與供體對照比較，分別提高2.35倍和1.40倍，其中，游離脯氨酸和蛋白質組分脯氨酸分別提高6.6倍和3.0倍，且脯氨酸合成途徑必需的r-谷氨酸激酶的活性提高了2.5倍。

3 羊草酶蛋白類研究

蛋白質是生物體生命中的第一重要物質，是生理功能的執行者，是生命現象的直接體現者，同時能夠調控相關基因的表達，植物對抗非生物脅迫必然有蛋白質的參與，比如耐冷蛋白、熱休克蛋白、水通道蛋白、赤霉素信號傳導蛋白等，從羊草中檢測這些蛋白的含量以及克隆表達該蛋白的基因對于研究羊草耐逆分子機理和改善羊草品質都具有重要意義。

目前對于羊草酶蛋白的研究還遠遠不夠，主要有細胞色素氧化酶、過氧化物酶、脂酶同工酶等，其應用也僅局限于闡明羊草的遺傳分化，通過聚類分析可以研究羊草種群在不同地理及生態環境中羊草在分子水平上細胞色素氧化酶同工酶存在著種內分化，羊草在同工酶水平上的分化受多個環境因子的綜合影響，而且與羊草耐寒性能存在一定的內在聯系，張麗萍等對采自同一天然草地上葉片呈黃綠色、灰綠色兩種類型羊草的根、莖、葉的過氧化物同工酶、脂酶同工酶進行了分析比較，結果表明，兩種葉色羊草，其相同組織的過氧化物同工酶譜及脂酶同工酶譜基本一致，兩種羊草葉片呈現不同顏色只屬不同生態型，

磁場處理不僅可以促進羊草的生長。而且還能提高羊草的抗鹽堿性，磁場使羊草過氧化物酶(POD)活性提高，并且誘發了一條新的同工酶帶，張衛東等認為羊草自交不孕的原因是自交不親和性障礙。并利用禾本科植物自交不親和性有關的硫氧還蛋白(thsioredoxin)^基因設計的引物在羊草DNA中檢測到預期片段，說明硫氧還蛋白h基因可能與羊草的自交不親和性有關，該基因現已被克隆并能夠從GenBank中查到其序列。

研究羊草草原土壤酶的活性可以判斷土壤的肥力，土壤肥力水平接近則土壤酶的活性相似，土壤蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶的活性與土壤有機碳、全氮呈顯著相關關系，可以反映土壤肥力水平高低，是評價土壤退化的重要指標。

4 羊草耐逆基因的分離與克隆

羊草具有耐寒、耐旱、耐鹽堿的特性，并且蛋白質含量較高，說明羊草在面對非生物脅迫時高效表達能夠適應、緩解或對抗相應逆境條件的物質，尤其是調控這些物質表達的酶類基因，據報道，羊草種子個體萌發期最大忍受pH范圍是9.14-9.53，對于NaCl可耐受的最大強度為600mmol/L，對于Na2C03可耐受的最大強度為175mmol/L，為了弄清這種適應機制的復雜性，通過大規模的cDNA克隆或者表達序列標簽(EST)的測序分離相關基因是非常重要的，Jin等采集自然生長的植物葉組織經過Na₂CO₃脅迫處理構建了cDNA文庫，并對其EST進行測序對比分析，推斷在羊草葉和根中各有39和31個非生物脅迫相關基因，這些EST資源將有助于對植物耐鹽堿分子基礎的深入研究和理解。

甜菜堿是在生物體內起著滲透保護作用最主要的細胞相溶性物質，編碼決定該物質合成的關鍵酶一甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因已經先后從多種生物體內得到克隆，并在多種植物中進行了遺傳轉化。已獲得了抗鹽、抗寒、耐旱能力得到較大程度提高的轉基因植株，某些植物體內的甜菜堿含量和BADH活性隨著土壤鹽堿化程度的加重而增加，因此推測甜菜堿可能與羊草耐鹽堿性有關，目前羊草中的部分BADH基因片段也已經被成功克隆。

5 問題與展望

分子生物學技術自其應用以來，以其不可逆轉的滲透能力和交叉能力與各個學科齊頭并進、相輔相成、共同發展，許多生物現象的機理機制都要最終依賴分子生物學手段予以闡明，以往對羊草生物學以及生理生態學進行了比較深入的探討，但對于羊草分子生物學的研究起步較晚。進展也比較緩慢，近年來，隨著分子生物學研究手段和技術的進步，以及羊草遺傳改良的需要。人們在羊草遺傳多樣性、愈傷組織培養、酶蛋白分析以及基因克隆與轉化等研究領域陸續開展了一些有益的嘗試，并取得了許多重要研究成果，今后應在分子水平上，如對羊草自交不親和性，非生物脅迫耐受機理，種子休眠機理，關鍵酶基因的分離克隆與轉化，轉基因羊草對周圍環境的潛在影響等諸多方面加以深入探討與研究，必將為羊草資源的保護和合理利用提供充分的理論基礎。

作者簡介：孔祥軍(1980—)，男[滿]，河北承德人，博士研究生，主要從事植物抗逆分子機理研究；梁正偉(1962—)，男，吉林長春人，博士，研究員，博士生導師，通訊作者，主要從事植物逆境生理生態與分子生物學研究。