擬南芥ＡｔＭＧＴ３基因轉運功能研究

摘 要：對擬南芥AtMGT3基因的Mg²⁺轉運功能進行了初步研究，AtMGT3轉錄本的半定量分析表明，AtMGT3在根、莖、葉、花、角果中均有表達，但在花中表達量最高，根中最少，MM281功能互補和液體生長曲線結果表明：AtMGT3功能互補細菌Mg²⁺轉運突變株，具有Mg²⁺轉運能力；AtMGT3介導Mg²⁺的低親和性吸收，是一個低親和性Mg²⁺轉運蛋白；AtMGT3可能還能轉運Fe²⁺，但轉運Fe²⁺濃度超出了正常的生理濃度，在正常生理條件下，At-MGT3的主要生理功能是作為Mg²⁺轉運蛋白起作用。

關鍵詞：AtMCT3；功能互補分析；低親和Mg²⁺轉運蛋白

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0328-06

Mg²⁺是植物細胞中最豐富的二價金屬離子，其在一系列酶促反應中作為輔因子起作用，Mg²⁺是構成葉綠素的主要組成成分和酶的活化劑，參與脂肪代謝，促進磷素的轉運以及某些維生素的合成；并且參與維持細胞膜的穩定；Mg²⁺對植物液泡離子通道以及葉綠體RNA的穩定性都有重要的調控作用，缺失足夠的Mg²⁺，核糖體亞單位將會分離，同時細胞膜也會變成松弛滲漏的狀態，離子狀態的鎂調節許多重要的酶促代謝，還可通過特定的金屬結合位點在膜蛋白通道中起作用。

由于Mg²⁺獨特的幾何特性和化學特性，有人猜測其轉運系統也具獨特性，細菌中的研究支持該假說，目前，整個生物界中已發現有五大Mg²⁺轉運家族：CorA家族、Mg²⁺/H⁺交換體、離子通道、P型磷酸酶和MgtE基因家族，主要的Mg²⁺轉運家族是細菌中的CorA家族，CorA序列上存在保守基序GMN，是其轉運Mg²⁺所必需的，若GMN基序中有一個氨基酸突變，其轉運能力就會喪失，ALRl和ALR2是在酵母中發現的一類CorA基因，在酵母中過量表達ALR蛋白可提高其對鋁毒害的抗性，MgtA/B是5，typAimurium中發現的另外兩個具Mg²⁺轉運能力的基因，兩個都是大的復合跨膜蛋白，屬于P型磷酸酶家族，它們的表達受到低濃度Mg²⁺的誘導。

到目前為止，在高等植物中鑒定出兩類具Mg²⁺轉運活性的轉運蛋白：一類是Mg²⁺/H⁺交換體，它是一類質子依賴性轉運蛋白；另一類是CorA-like鎂離子轉運蛋白。

1999年Shaul在模式植物擬南芥中克隆到一個在液泡膜上編碼轉運蛋白的基因AtMHX，AtMHX是第一個從多細胞有機體中克隆到的Mg²⁺轉運蛋白，也是在植物中首個被發現的Mg²⁺/H⁺交換蛋白。其作為一種Mg²⁺(Zn²⁺)/H⁺交換蛋白發揮作用Ls，Northern雜交分析顯示，AtMHX mRNA在擬南芥的各個組織中均有表達。

CorA家族是五大Mg²⁺轉運基因家族最大的一個，其廣泛存在于細菌、真菌、酵母、哺乳動物和高等植物中，其蛋白具有獨特的拓撲結構，2002年Li等在擬南芥中鑒定出一個與細菌CorA同源、蛋白結構相類的AtMGT家族，此家族有10個成員，成員的氨基酸序列多樣，氨基酸的同源性范圍從15％～89％，在家族的系統發育中，AtMGTl和AtMG72，AtMGT5和AtMGT6，AtMGT7、tMGT8和AtMGT9各自成簇，親緣關系較近，而且tMGTIO在系統發育中另外分支，與其它成員親緣關系較遠。

目前AtMGT基因家族已有的研究表明，AtMGT家族存在兩種Mg²⁺轉運蛋白：高親和性Mg²⁺轉運蛋白和低親和性Mg2²⁺轉運蛋白。高親和性Mg2+²⁺的轉運是在低濃度范圍內進行的，其主要依靠轉運體來完成，擬南芥AtMGT家族中的AtMGT1、AtMGT2和AtMGT10這3個蛋白的氨基酸序列上都含有2個疏水的跨膜區，并且第2個跨膜區上都有保守基序GMN，已鑒定屬于高親和性Mg²⁺轉運蛋白，AtMGTl功能互補細菌Mg²⁺轉運突變體，不僅能轉運Mg²⁺，還能轉運別的二價陽離子如：Fe²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、CO²⁺等，但轉運這些陽離子的濃度都超出了植物正常生長的生理濃度，因此該基因的功能主要是進行Mg²⁺轉運，AtMGT2參與呼吸作用，AtMGT10功能互補酵母M廣轉運突變體，定位于質膜上，低親和性Mg²⁺轉運是在外界Mg²⁺濃度為m mol/L級進行轉運，且在生理濃度范圍內不會達到飽和，已從AtMGT家族中鑒定出第一個低親和性Mg²⁺轉運蛋白-AtMGT7，通過MM281功能互補發現AtMGT7轉運Mg²⁺的能力受到pH值的影響，本研究的對象AtMGT3亦屬于低親和性Mg²⁺轉運蛋白，

多個轉運蛋白基因與Mg²⁺轉運有關，它們可能在植物細胞不同的膜上起作用，除了質膜外，細胞中還有很多其它細胞器膜，如線粒體膜、葉綠體膜、液泡膜、高爾基體膜等，已知AtMGT1、AtMGT7和AtMGT10定位在質膜上，AtMGT2定位在線粒體內膜上，AtMHX在液泡膜上介導Mg²⁺的轉運；其它的Mg²⁺轉運蛋白也有可能在其它細胞器膜上發揮作用，然而，即使某些基因定位在相同的膜上，它們也可能在植物的不同組織中，或者相同組織的不同發育時期起到Mg²⁺專運功能，

本研究以AtMGT3基因為研究對象，目的在于鑒定AtMG73蛋白的轉運特性，進而分析AtMGT3的蛋白結構與轉運以及轉運親和性的高低之間的關系，探討AtMGT3在植物的生長發育過程中的生理功能，為進一步的揭示Mg²⁺轉運機制打下基礎，以上還只是Mg²⁺轉運機制的初步研究，Mg²⁺轉運基因家族的轉運機制，以及在植物體內的生物學功能，尚需更進一步的研究。

1 材料和方法

1．1 菌株的生長條件

E.coli DH5a在37℃，LB培養基中生長，并添加相應抗生素，S.typhimurium MM281需要高濃度Mg²⁺才可以生長，它被用于功能互補實驗，于37℃，Mg²⁺(以MgS04的形式添加)終濃度為100mmol/L，氯霉素濃度為34mg/L的LB或N-minimal培養基中生長。

1．2 載體、酶類及各種試劑盒

pMDl8-T載體和實驗中用到的所有酶類均購自大連寶生物工程有限公司，質粒純化及膠回收試劑盒購自長沙安比奧生物技術公司，pTrc-99A由本室保存。

1．3 AtMGT3基因的克隆及載體構建

擬南芥基因組DNA按照Robert K FlamnC的方法提取，根據AtMGT3基因序列利用PrimerPremier 5.0軟件設計一對引物，正向引物序列為5′-TYGGACTCCTYCTGTYI'CACTGG-3′，反向引物序列為5′-AAGCCTAAGCTCAGCA AAAGACA-3′，用高保真酶Pyrobest DNA Polymerase進行PCR擴增，回收目的片段，連接到pMDl8-T載體上，再用EcoR I和j(pn I酶切，定向克隆至表達載體pTrc99A，并酶切鑒定陽性克隆。

1．4 生物信息學分析的主要軟件及數據庫

基因序列數據由NCBI中獲得，跨膜區分析軟件為TMHMM，多序列比對軟件為ClustalW，常規的核酸蛋白分析軟件利用DNAMAN進行。

1．5 表達模式分析

根據Ambiogen公司的RNA提取方法提取各個組織的總RNA：根、莖、葉、花、果；取相同量的不同組織的RNA，用eDNA合成試劑盒M-MLVReverse Transcriptase(Invitrogen公司)合成cDNA，應用軟件Primer Premier 5.0設計特異的表達模式引物：正向引物序列為5′-CCTrGACCCTITGTI'TATCTATC-3′，反向引物序列為5′-CTCAGTCAAATACATCTCAGCC-3′，PCR擴增：以β-Actin作為內參，以不同組織的總eDNA作為模板進行PCR擴增，最后進行瓊脂糖電泳檢測。

1．6 MM281功能互補實驗

挑取MM281，MM281-pTrc99A，MM281-PTrC99A-AtMGTl0，MM281，pTrc99A-AtMGT3的單菌落在試管中過夜培養，然后再按50:1(50mLLB:1 mL菌液)的比例接種于含有相應抗生素的錐形瓶中擴大培養。

測菌OD₆₀₀，當達到0.6～0.7時加入1mmol/L的IPTG進行誘導，誘導至OD₆₀₀達到1.0時取出轉化的菌液100μL，以10的倍數稀釋10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-4mmol/L 5個濃度梯度，將稀釋的菌液各取2μL點樣于互補N-Minimal固體培養基上，37℃倒置培養2d，觀察菌落生長情況。

1．7 液體生長曲線

挑取MM281，MM281-pTrc99A-AtMGTl0，MM281-pTrc99A-AtMGT3的單菌落在含相應抗生素的LB中搖菌，搖至OD₆₀₀=0.6～0.8時，5000g離心收獲細胞，用去離子水清洗兩遍，以除去殘留的Mg²⁺，然后懸浮在去離子水中，準備4種不同Mg²⁺濃度(100μmol/L，500μmol/L，2mmol/L，10mmol/L)和相應抗生素的N-minimal培養基，將上述準備好的培養物(起始OD₆₀₀=0.001～0.002)加入N-Minimal培養基，37℃菌，24h測OD ⁶⁰⁰監測生長情況。

1．8 陽離子敏感性實驗

配制pH 7.0含0.1mol/L Mg²⁺的不同二價離子N-Minimal固體培養基，這些二價陽離子包含Cd²⁺、CO²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺，每種離子分別配制了一系列的濃度梯度(0、10、100μmol/L，1、10mmol/L)。

按功能互補實驗過程一樣準備好菌液，然后點至不同濃度的金屬離子板上，37℃倒置培養1d后觀察其生長情況并拍照。

2 結果與分析

2．1 AtMGT3的cDNA序列的結構分析

用從擬南芥基因研究中心(ACI)得到的基因信息，設計特異性引物，通過RT-PCR來擴增AtMGT3基因的預測編碼區，通過測序分析，所得到AtMGl3的開放閱讀框含有1266 bp的核苷，編碼421AA的蛋白，其序列與AGI中心預測的序列一致，與AtMGT1相比，AtMGT3的C端序列有兩個跨膜區，第1個跨膜區是Leu³³⁷和Asn³⁷⁹之間，第2個跨膜區是Phe³⁹¹和Phe⁴¹³之間，AtMGT3擁有完整的轉運鎂離子的結構(圖1 A，B)。

2．2 AtMGT3的表達模式

以β-Actin作為內參，對AtMGl3進行表達模式分析，通過平臺期摸索，確定了Actin基因在32個循環時達到平臺期；而AtMGT3基因在35個循環時達到平臺期，因此，在表達模式分析中，Actin引物進行29個循環的擴增，AtMGT3引物進行32個循環的擴增，由圖2可以看出，AtMGl3在根、莖、葉、花、果中都有表達，其中，在花中的表達量最高，而在根中的表達量最低。

2．3 AtMGT3可功能互補MM281的生長

MM281是一類喪失了CorA，MgtA，MgtB Mg²⁺轉運系統的沙門氏桿菌突變株，它只能在高濃度Mg²⁺(＞100mmol/L)下達到最佳生長速度，結合功能互補的方法，它可作為一個研究Mg²⁺轉運的很好的系統，表達了AtMGT3的MM281重組菌株可在低濃度Mg²⁺情況下生長，而其陰性對照MM281，MM281-pTrc99A則只能在大于10mmol/L的N；minimal培養基上生長(見圖3)，互補結果可以說明AtMGT3的表達互補了MM281在Mg²⁺轉運上的功能缺失，使之重新具有了Mg²⁺轉運能力，從而使其可在含低濃度(＜10mmol/L)M廣的培養基中生長，然而， 陽性對照MM281-pTrc99A-AtMGTl0能生長在低至100μmol/L Mg²⁺的培養基上，與高親和性的鎂離子轉運蛋白AtMGT10相比，AtMGT3的轉運能力明顯低于AtMGt10。

MM281，MM281-pTre99A-AtMGTl0和MM281-pTre99A-AtMGT3 3種菌液生長在含100、500μmol/L，2、10 mmol/L Mg²⁺(含相應抗生素)的N-Minimal培養基上，24h內連續測OD₆₀₀值進行監測，由圖4可知，表達了目的基因的MM281轉化子可在2mmol/L的N-minimal培養基中生長，而陰性對照只能在10mmol/L的培養基中生長。生長曲線結果與MM281功能互補結果基本一致，也再次證明了目的基因的轉運能力，但轉運功能明顯低于AtMGT10。

2．4 AtMGT3的表達改變了MM281對二價鐵離子的敏感性

已有研究顯示，當細菌中積累一定量的重金屬離子(如CO²⁺，Cd²⁺，Mn²⁺，Zn2~²⁺)時，就會對細菌本身產生毒害作用并使之死亡，由圖5可知，表達了AtMGT3基因的轉化子增加了對Fe²⁺的敏感性，當Fe²⁺離子濃度達到5mmol/L時，表達了目的基因的菌株就會死亡，我們可以認為AtMGT3有Fe²⁺離子的轉運能力，我們也進行了Co²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺的離子敏感性實驗，但沒有發差別(數據未顯示)，然而，轉運Fe2~的濃度較高，達到了5mmol/L，在自然條件下極其罕見，因此我們推測，AtMGT3主要還是行使Mg²⁺轉運功能。

3 討論與分析

植物細胞內各種離子(包括Mg²⁺)和營養物都必須達到良性動態平衡，以此保證細胞內環境的穩定，Mg²⁺在植物的生長發育中起著重要的作用，對維持植物體內的離子動態平衡具有重要作用，植物必須在整體水平和細胞水平上嚴格控制鎂離子的轉運，以適應土壤中不斷變化的鎂離子含量及應付其它形式的脅迫。

擬南芥AtMG了家族10個成員中已有4個成員AtMGTl、AtMGT2、AtMGT7、AtMGTl0被鑒定具Mg²⁺轉運功能，其中AtMGT1、AtMGT2、AtMGT10為高親和性鎂離子轉運蛋白基因，AtMGT7是鑒定出的第1個低親性的鎂離子轉運蛋白基因，AtMGT3是鑒定出來的另一個低親和性的鎂離子轉運蛋白基因。

本研究通過表達模式分析表明：AtMG73在擬南芥中主要在花中表達，在莖、葉、角果中也有表達，而在根中的表達量最少，生化研究表明：AtMG73具有鎂離子及其他陽離子轉運能力，AtMGT3功能互補細菌Mg²⁺轉運突變株，具有Mg²⁺轉運功能，但對Mg2~的親和性較低，是一個低親和性M廣轉運蛋白，AtMGT3還能轉運別的陽離子，如Fe²⁺，但是轉運Fe²⁺離子的濃度較高，在自然條件下罕見，因此可以推測，在生理條件下AtMGT3主要選擇Mg²⁺，是一個Mg²⁺轉運蛋白。

植物中為什么會存在高親和與低親和兩種不同機制的Mg²⁺專運蛋白?這可能有以下幾個原因：

1)植物根系對Mg²⁺的吸收轉運可能存在兩種機制：高親和Mg²⁺吸收(uizh affinity Mg²⁺uptake)與低親和Mg²⁺吸收(Low-affinity Mg²⁺uptake)，高親和Mg²⁺轉運蛋白可能在外界Mg²⁺濃度低時(為μmol/L范圍內)發揮作用。低親和Mg²⁺轉運可能在外界Mg²⁺濃度高時(在mmol/L水平)發揮作用，為了適應土壤中不斷變化的鎂離子含量及應付其它形式的脅迫，就需要有不同特性的Mg²⁺轉運蛋白來介導植物根部對Mg²⁺的吸收。

2)在細胞本身的內環境中，不同的亞細胞環境中Mg²⁺的濃度也不一致，多個轉運蛋白基因與Mg²⁺轉運有關，它們可能在植物細胞不同的膜上起作用，除了質膜外，細胞中還有很多其它細胞器膜，如線粒體膜、葉綠體膜、液泡膜、高爾基體膜等，已知AtMGT1、AtMGT7和AtMGT10定位在質膜上，AtMGT2定位在線粒體內膜上，AtMHX在液泡膜上介導M廣的轉運；其它的Mg²⁺轉運蛋白也有可能在其它細胞器膜上發揮作用，然而，即使某些基因定位在相同的膜上，它們也可能在植物的不同組織中，或者相同組織的不同發育時期起到Mg²⁺轉運功能，因此在植物的不同發育時期以及不同的亞細胞結構之間需要有不同轉運特性的Mg²⁺轉運蛋白來介導Mg²⁺的轉運，維持植物細胞中Mg2~的動態平衡。

綜上所述，我們對Mg²⁺轉運基因AtMGT3進行了生化功能的初步研究，進一步的研究可集中于AtMGT3轉運Mg²⁺的直接證據，如原子吸收分光光度實驗，同位素示蹤實驗，及其轉運Mg²⁺是否是離子偶聯的，又與何種離子偶聯，從而為更好地理解AtMGT家族轉運Mg²⁺的分子機制提供新的信息。

作者簡介：鄧沛怡(1982—)，男，湖南懷化人，碩士研究生，主要從事植物分子生物學研究；李東屏(1966—)，男，湖南安鄉人，湖南師范大學副教授，博士，通訊作者，主要從事植物分子生物學研究。