蘇云金桿菌Ｂｔ０６０１菌株發酵培養基的優化

摘 要：運用正交試驗L₁₈(3³)設計對攜帶殺蟲基因cry/Ac和虎紋捕鳥蛛毒素基因hwtx-I的蘇云金桿菌工程菌Bt0601的發酵培養基進行了優化研究，試驗獲得的最佳優化復合培養基配方為(％)：玉米粉1.0，黃豆餅粉0.50，酵母膏0.15，蛋白胨0.05，磷酸二氫鉀0.75，碳酸鈣0.05，硫酸鎂0.035，Bt0601在該優化培養基下發酵，48h每mL發酵液產芽孢11.4×10⁹個，伴孢晶體23.0×10⁷個，對3齡小菜蛾(Plutella xylostella)48h的致死率達96.7％，普通發酵培養基下相應的芽孢產量為9.33×10⁹個，伴孢晶體9.57×10⁷個，毒力為68，5％。

關鍵詞：蘇云金桿菌：工程菌；發酵培養基；正交設計

中圖分類號：Q936 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0323-05

蘇云金芽孢桿菌(簡稱Bt)發酵生產的殺蟲劑因具有安全、高效的特性而廣泛應用于農林害蟲的防治。在Bt的發酵生產中，優良的發酵培養基是影響Bt發酵產物殺蟲效果的關鍵因素之一，高濃度培養基中各種營養素的配比對Bt菌株的生長和晶體蛋白的產生至關重要，而且不同的Bt菌株因其遺傳基礎和表達蛋白種類的差異有不同的營養需求，為便于工業化生產，發酵培養基一般選擇以生產成本較低廉的農副產品為主要碳氮源，申燁華等分別以玉米粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、魚粉等為主要原料對工業上投入廣泛使用的HD-1菌株的發酵培養基進行優化，獲得了最佳碳氮比(CV/ )為2.0的優化培養基，王善利等以黃豆餅粉、可溶性淀粉、蛋白胨和無機鹽對HD-1菌株的發酵培養基進行優化，同樣獲得了另一個優化發酵的培養基配方，本研究室的丁學知也對本室篩選的Bt4.0718菌株的發酵培養基和條件進行了系列優化，成功地為Bt4.0718菌株的工業化生產提供了依據。

隨著Bt殺蟲劑的廣泛應用，其安全、環保、特異的優點越來越受到人們的青睞，但其弊端也日漸明顯，如殺蟲效果不如化學農藥好，選擇性強而不具有廣譜性，害蟲容易產生抗性，針對這些缺點，本研究室利用基因工程技術，將來源于虎紋捕鳥蛛(Selenocosmia huwena)的Huwentoxin-I(簡稱HWTX-I)毒素基因與Bt殺蟲基因crylAc融合，并克隆到蘇云金桿菌無晶體突變株XBU001中，構建了一株高效殺蟲工程菌Bt0601，HWTX-I是一種多肽類神經毒素，能阻斷N-型乙酰膽堿和谷氨酸介導的神經一肌肉傳導，從而麻痹害蟲，將hwtx-I基因與crylAc基因融合，產生的融合蛋白CrylAc-HWTX-I既可發揮CrylAc毒素蛋白的高效殺蟲性，又可發揮蜘蛛毒素HWTX-I的麻痹作用，從而導致害蟲更快的死亡，并對抗CrylAc毒素的昆蟲重新敏感，前期研究結果顯示，Bt0601菌株對3齡小菜蛾的毒力比只攜帶crylAc基因的工程菌毒力高20.6％，考慮到工程菌大量表達的毒素基因的差異，其營養需求與野生型菌株可能也有較大差異，故本研究對工程菌Bt0601的最佳發酵培養基進行優化，以期獲得毒力更高的產物，為Bt工程菌的發酵、Bt殺蟲劑的工業化生產和應用提供一定的基礎。

1 材料與方法

1．1 供試菌株

Bt0601工程菌株，無晶體突變株XBU001中轉入攜帶crylAc、hwtx-I融合基因的pHT304載體，為湖南省微生物分子生物學重點實驗室龍小山構建。

1．2 培養基

1．2．1 普通培養基：

牛肉膏1％，蛋白胨0.3％，KH₂pO₄0.1％，pH 7.5；固體培養基再加2％的瓊脂。

1．2．2 發酵培養基I：

蛋白胨1.0％，牛肉膏0.5％，葡萄糖0.3％，NaCl 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，K₂HPO₄ 0.03％，MnS04 0.005％，pH 7.2。

1．2．3 發酵培養基Ⅱ：

以玉米粉、黃豆粉為主要原料，輔以酵母粉、蛋白胨以及磷酸二氫鉀、碳酸鈣及硫酸鎂，正交試驗采用L₁₈(3⁷)設計(表1)，將優選出的培養基組合進行綜合評比。

1．3 培養方法

將斜面活化的Bt0601菌株接種到5mL普通培養基中，30℃振蕩培養8h后，以2％的接種量轉接到30mL發酵培養基中，250r/min，30℃搖瓶振蕩培養，至80％胞晶脫落停止培養。

1．4 測定方法

1．4．1 芽孢和晶體形態觀察

用草酸胺結晶紫染色在油鏡下觀察芽孢和晶體的形態。

1．4．2 芽孢記數

采用血球計數板計數蘇云金桿菌芽孢和伴孢晶體含量，結果采用DPS2000數據處理系統分析。

1．4．3 生物測定方法

采用浸葉飼喂法，測定Bt0601菌株發酵液對3齡小菜蛾的殺蟲效果，即用取500μL菌液加入150mL無菌水配制好的Bt供試藥液浸泡小白菜葉片，5min后取出，晾干后加入養蟲瓶中，以無菌水浸泡的葉子為空白對照，接人10條大小一致、已饑餓24h的小菜蛾3齡幼蟲，25℃恒溫飼養，48h后統計致死率，試驗重復3次。

1．4．4 發酵特性研究

以2％的接種量將活化的Bt0601菌株接人優化發酵培養基中，250r/min，30℃搖瓶振蕩培養，每4h取樣測定其在600nm的吸光值和pH值，研究該菌株在搖瓶發酵過程中的生長特性和pH變化情況。

2 結果

2．1 Bt0601工程菌發酵培養基優化設計

蘇云金桿菌發酵產品質量考核主要以發酵液芽孢、晶體含量和殺蟲效價為指標，但是實際生產中主要以發酵液中芽孢含量為考核標準，本研究對正交試驗獲得的發酵液孢子和伴孢晶體含量均進行了方差分析(表2～4)。結果顯示，培養基中玉米粉、黃豆餅粉、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氫鉀、碳酸鈣及硫酸鎂的水平改變對提高芽孢和晶體含量均有影響；培養基中玉米粉與黃豆粉、黃豆粉與酵母粉的交互作用對提高芽孢含量也有影響(表2)；而玉米粉對伴孢晶體的形成影響最顯著，從試驗各因子不同水平對芽孢和晶體含量的影響(表2～4)可知：培養基中玉米粉的最佳選擇是3水平1.0％；黃豆粉的最佳選擇是1水平0.5％；酵母膏的最佳選擇是3水平0.15％；蛋白胨的最佳選擇是2水平0.05％；磷酸二氫鉀的最佳選擇是3水平0.75％；碳酸鈣的最佳選擇是1水平0.05％；硫酸鎂的最佳選擇是2水平0.035％，因此，在實驗室搖瓶發酵條件下蘇云金桿菌Bt0601工程菌的最佳培養基配比為：A₃B₁C₃D₂E₃F₁G₂，即玉米粉為1％，黃豆餅粉為0.5％，酵母膏為0.15％，蛋白胨為0.05％，磷酸二氫鉀為0.75％，碳酸鈣為0.05％。硫酸鎂為0.035％，Bt0601在I-16發酵培養基中，30℃，振蕩培養48h左右，每mL發酵液產芽孢達11.4×10⁹個，伴孢晶體為23×10⁷個。

本研究還比較了Bt0601菌株在以玉米粉、黃豆粉為主要原料的工業發酵培養基和實驗室普通發酵培養基(I)中的發酵差異。研究發現，Bt0601菌株在普通發酵培養基，發酵周期稍短，44h左右孢晶脫落率達80％，每mL發酵液產芽孢9.33×10⁹個，伴孢晶體9.57×10⁷個，而在工業發酵培養基中48h孢晶脫落率才能達到80％，但每mL發酵液的芽孢產量和晶體產量卻高于普通發酵培養基。

2．2 發酵培養基對Bt0601工程菌殺蟲毒力的影響

不同發酵培養基下搖瓶發酵生產的Bt0601工程菌發酵液對3齡小菜蛾的殺蟲效果如表5所示，不同組合配方的發酵培養基培養的Bt0601工程菌發酵液對3齡小菜蛾均有較高的毒力，且I一3，I-7，I-8，I-9，I-10，I-12，I-16，I-17，I-18發酵培養基發酵生產的Bt0601工程菌發酵液對小菜蛾48h的致死率均達90％以上，其中I-16的致死率最高，達96.7％，而對照發酵培養基中培養的發酵液對小菜蛾的致死率為68.5％，該結果與發酵液芽孢和晶體產量統計結果基本一致。

2．3 Bt0601工程菌的發酵特性

以2％的接種量將活化的Bt0601工程菌接人起始pH 7.5的優化發酵培養基中，30℃發酵培養，其生長曲線如圖1，結果顯示，0～12h為延滯期，12～28h為對數生長期，菌體濃度逐步增大，32h菌體濃度達到最大，28～44h菌體數變化不大，為穩定生長期，44～48h菌體濃度開始下降，進入衰退期，通過涂片觀察，12h有少量菌絲體，24h有芽孢生成，32h有伴孢晶體生成，36h有菱形晶體出現。

2．4 XBU001工程菌株發酵過程中pH的變化

發酵過程中pH值的變化，是菌體在一定的環境條件下代謝活動的綜合性指標，它集中反應了菌體的生長代謝和產物合成的情況，圖1為Bt0601菌株在優化發酵培養基中發酵液pH值的變化曲線，發酵前期(0～12h)，pH值有所下降，這可能與延滯期酸性產物的積累有關，中期pH值上升，此時菌體從以碳素代謝為主的生長期逐漸轉為以氮素代謝為主的產物合成期，NH⁺₄的濃度變化非常活躍；后期隨著代謝的減慢或者停止，NHNH⁺₄濃度變化仍然很活躍，發酵液的pH值也繼續上升，通過鏡檢發現，后期發酵液的菌體量明顯下降，且有大量的菌體碎片存在，發酵后期發酵液pH值的上升可能是由于菌體死亡并伴隨著菌體自溶造成的。

3 討論

Bt0601菌株是攜帶兩種不同毒素基因的工程菌，通過對其發酵培養基的優化，找到一種適合該菌株芽孢和晶體形成的優廉發酵培養基(％)：黃豆餅粉0.5，玉米粉1.0，酵母膏0.15，蛋白胨0.05，KH₂PO₄ 0.75，CaCO₃ 0.05，MgSO₄ 0.035，pH 7.5，與普通發酵培養基相比，Bt0601在優化培養基中延滯期稍長，發酵周期也偏長，但芽孢和晶體產量分別提高22.2％和140.3％，毒力也相應提高28.2％，這可能與粗原料的利用速度較慢，但有利于芽孢晶體形成有關，我們的研究結果還發現，攜帶外源基因的工程菌Bt0601在同樣的發酵條件下，發酵周期比野生型菌株Bt4.0718菌株要長，最早形成芽孢和晶體的時間要晚，這可能與外源基因在Bt菌株中被識別并進行表達調控有關，對Bt0601菌株最佳發酵培養基的確定，為實現Bt0601菌株的工業化發酵生產提供了一定的基礎，本研究后續工作將對該菌株的發酵條件進行系列實驗，并在30L發酵罐中進行驗證。

作者簡介：陳宇(1972—)，女，貴州安順人，講師，碩士，主要從事微生物發酵研究。