人ＨＴＲＩＥ基因在不同細胞系和多種組織中的表達及其功能

摘 要：人的HTRIE基因是五羥色胺受體(HTR)家族中的一員，這個家族里面的基因都和精神分裂癥、抑郁癥以及人的自殺活動有關，但是對于其具體的作用機制目前研究不多，采用實時定量PCR方法分析了HTRIE基因在各個組織和不同細胞系中的表達情況，亞細胞定位發現HTRIE位于細胞膜上，螢光素酶實驗分析確定HTRIE可以抑制原癌基因erbB2啟動子的轉錄活性，這些研究結果為進一步研究HTRIE基因在疾病發生中的作用奠定了一定的基礎。

關鍵詞：HTRIE；表達譜；實時定量PCR：轉錄活性

中圖分類號：Q7 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847(2007)04-0311-05

人類的五羥色胺受體可以分為7種類型，即5-HTRI～7，這7種類型又可以分為14種亞型，分別為：HTR1A，HTR1B，HRTIC，HTRID，HTRIE，HTI1F，HTR2A，HTR2B，HTR2C，HTR3A，HTR4，HTR5A，HTR6，HTR7，有研芋云表明HTR7和HTR4都可以激活轉錄因子固醇反應元件(serumresponse element，SRE)的轉錄活性，在NIE-115細胞系中過表達5-HT4(a)可以使其變圓，在海馬神經元中，HTR7有使神經軸突變長的功能，HTRlB能夠和S100A10，Pll(annexin 2 lightchain)蛋白質發生相互作用，而且發現HTRlB對下游ERK1/2的Thr202/TYr204磷酸化具有調控作用，而且可以通過和pll相互作用抑制神經沖動的傳導，人HTRIE基因位于染色體的6q14-q15，并且含有7個跨膜結構域，因此屬于G-蛋白偶聯受體家族，目前發現此蛋白質在背根神經中樞有表達，并且具有抑制cAMP的形成，而且在去甲腎上腺素、腎上腺素、組氨、多巴胺和褪黑激素的刺激下，其蛋白質的表達情況沒有任何變化，研究發現在阻斷劑methiothepin的刺激下，HTRlE抑制cAMP的形成作用消失，有研究表明，五羥色胺誘導鈣離子釋放是通過激活HTR1E來實現的，而且發現HTtR1E可以調節細胞因子IL-6和CXCL8/IL8的釋放，因此HTR1E可能在激活各種細胞信號途徑以及調節細胞因子的釋放起到了很重要的作用，我們通過對HTRIE基因在各個組織和細胞系中的表達情況以及亞細胞定位分析，為以后對HTRIE功能的研究打下基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

真核表達載體pEGFP-C3和含有erb B2啟動子的報告基因pTAL-luc-erbB2購自Clontech公司，pMDl8-T載體、不含erbB2啟動子區域的報告基因的載體pTAL-luc、各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、T4聚合酶及反轉錄試劑盒購自TaKaRa，LipofectamineTM 2000轉染試劑盒，總RNA提取的TRIZOL試劑購自Invitrogen，luciferase assay試劑盒購自Promega，SYBRGreen I熒光染料實時定量PCR試劑盒購自Applied Bio systems公司，倒置熒光顯微鏡為Zeiss產品，PE全自動熒光定量PCR儀為美國ABI 7900產品，熒光分光光度計TD-20/20為美國產品，T47D、HeLa、HepG2、Hep3B、SW480、MCF7等14種細胞系以及人的各種組織由實驗室保存。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養、總RNA的提取、cDNA的合成T47D、HeLa、HepG2、Hep3B、SW480、MCF7等細胞在37℃，5％CO₂，相對濕度95％條件下，用完全培養液DMEM(補加10％新生牛血清、2mol/L谷氨酰胺和100mg/L青霉素和100mg/L鏈霉素)培養，24h以后用PBS將細胞洗兩次，然后用細胞刮收集細胞，各種細胞系和組織按照Invitrogen公司試劑盒提供的方法進行，用反轉錄試劑盒合成各細胞系和組織的cDNA片段。

1．2．2 目的基因的擴增以及重組載體的構建

從人大腦組織中提取RNA，然后以反轉錄的cDNA為模板，以HTRIE引物對(sense primer：5′-CTCGAGATGAACATCACAAACTGTACCAC-3′，添加Xho I位點anti-sense primer 5′-GGTACCCTAAGTATGCTCTCGGCATCT-3′，添加gpn I)克隆人HTRlE編碼序列(1098bp)，然后亞克隆到pMDl8-T載體中，用Xho I/Kpn I酶切鑒定正確后，用Xho I/Kpn I酶切將目的片段切下，再亞克隆到同樣酶切處理的pEGFP-C3表達載體中，酶切驗證后測序分析，以確保讀碼框和序列的正確性。

1．2．3 實時定量PCR

用Trizol抽提各種細胞系的細胞總RNA，取總RNA 2μg用SuperscriptⅡ逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，再以逆轉錄反應液2μL作為模板，對TNFAIP l基因的表達采用實時熒光定量PCR檢測，定量引物采用Primer Express 3.0軟件設計(sense primer：5′-TCCACCAG CCTGCCAACTAC-3′anti-sense primer 5′-CCGTCCTCq'TCCTGGCGTAT-3′)；反應體系為：1×SYBR Green PCRMaster Mix，50mmol/L sense primer，50 mmol/Lanti-sense primer，100ng模板進行，反應條件為：95℃變性15s、60℃復性60s，72℃延伸60s，共40個循環，以β-actin作為內參照，用去離子水取代模板作陰性對照，用美國PE Biosystems公司提供的SDS2軟件進行數據處理，以RO值為縱坐標做直方圖，比較表達差異，每個樣品重復3次。

1．2．4 HTRIE亞細胞定位

用完全培養液DMEM培養Hep3B細胞長到70％～80％時，將pEGFP-C3-HTRIE轉染到Hep3B細胞，細胞培養24h后，用PBS洗細胞一次，然后用4％的多聚甲醛室溫固定10min，PBS洗兩次，隨后將50％的丙酮和50％甲醇混合液加入到細胞中室溫放置30s后，PBS洗兩次，然后加入終濃度為0.5mg/L的Hochest染色液，室溫放置30min，用PBS洗兩次后在熒光顯微鏡下觀察細胞。

1．2．5 螢光素酶實驗檢測HTR1E對erbB2轉錄活性的影響

用完全培養基DMEM培養HEK293Fr細胞，等到細胞長到70％～80％時，將pTAL-luc-erbB2與pEGFP-C3-HTRIZ，pTAL-luc與pEGFP-C3-HTRIE，pEGFP-C3與pTAL-luc-erbB2，pTAL-luc與pEGFP-C3分別共轉染到培養好的HEK293Fr細胞中，每組重復3次，每孔用LacZ共轉染到細胞中來平衡用量，轉染24h后，將細胞用PBS洗兩次，裂解細胞抽提蛋白，測定各組分蛋白的熒光強度。

2 結果

2．1 細胞和組織的總RNA的提取及構建真核表達載體的成功

將細胞和組織中提取的RNA各取2μL進行瓊脂糖電泳，可以觀察到清晰的28S、18S、5S條帶，RNA的提取效果理想，然后檢測各RNA的A₂₆₀/A₂₈₀值，其A₂₆₀/A₂₈₀值都在1.85左右，說明提取的RNA有著較高的濃度(圖1)，反轉錄后，克隆的人HTRIE基因片段在約1000bp處獲得單一目的條帶，與克隆基因1098bp的大小基本一致(圖2)，克隆基因亞克隆到真核表達載體pEGPF-C3中，Xho I/xpn I酶切驗證得到一條約1000 bp的條帶(圖3)，測序結果進一步說明HTRIE基因亞克隆到表達載體中，而且讀碼框正確。

2．2 HTRIE在各個組織和細胞系中表達分析

用RT-PCR檢測HTR1E在常見的細胞系和組織中的表達情況(圖4)，結果顯示HTRIE基因在細胞中的表達情況為：人的乳腺癌細胞T47D和纖維素瘤細胞HTl080-Tetoff表達量最低，而在人的肝癌細胞HepG2表達量最高，在所有檢測的組織中都有較高的表達，但是在肝臟組織表達量最高，在脾臟組織表達量最低，在實驗過程中，目的基因和內參β-actin在瓊脂糖電泳后都只有單一的一條帶，說明兩個基因都是特異性的擴增，實驗沒有污染(結果沒有顯示)。

2．3 HTRIE定位于細胞膜上

在Hep3B細胞中轉染pEGFP-C3-HTR1E，經過Hocheset染色后，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞核和目的基因的分布情況，結果發現HTR1E定位于細胞膜上(圖5)。

2．4 HTRIE可以抑制原癌基因erbB2的轉錄活性

將p7AL-luc-erbB2與pEGFP-C3-HTRIE，pTAL-luc與pEGFP-C3-HTRIE，空載體pEGFP-C3與pTAL-luc-erbB2，pTAL-luc與空載體pEGFP-C3分別共轉染到HEK293FT細胞中，每組重復3次，轉染24h后，測定報告基因的熒光值，結果發現在HEK293Fr細胞中過表達H7R1E后，報告基因erbB2的熒光值明顯下降，沒有erbB2啟動子的報告基因的pTAL-luc在過表達H7R1E后熒光值沒有明顯的下降的趨勢，這說明HTRlE對原癌基因erbB2的轉錄有抑制作用(圖6)。

3 討論

原癌基因ERBb2是表皮生長因子受體(EGFR)家族中的一員，研究發現，在小鼠中敲除erbB2基因11d后小鼠死去，并且其運動神經和顱神經嵴衍生感官神經節的發育也受到了嚴重的影響EGFR(erbBl)，erbB3和erbB4 3個基因都需要與配體的結合才能夠被激活，但是erbB2的激活并不需要與配體的結合，這意味著其他的信號分子也可以通過erbB2來傳遞信號，目前對與erbB2致癌的研究主要集中在細胞水平，并已經證實了erbB2可以通過G-蛋白偶聯受體的信號通路來激活，在許多類型癌癥中erbB2都出現過表達的情況，所以在治療癌癥時，erbB2也成為藥物治療的靶標，我們通過對HTREI的亞細胞定位發現，作為G-蛋白偶聯受體的HTRIE定位于細胞膜上，而且發現此基因在各個組織和細胞中都有表達，并可以抑制erbB2的啟動子的轉錄活性，這也就意味著HTRIE基因可能在癌癥的發生中扮演了重要角色，為以后HTRIE功能的研究打下了基礎。

作者簡介：吳艷陽(1981—)，男，湖南張家界人，碩士研究生，主要從事轉錄因子調控機理的研究；張健(1963—)，男，湖南長沙縣人，湖南師范大學教授，通訊作者，主要從事轉錄因子調控機理的研究。