龜鱉類線粒體全基因組的比較研究

摘 要：在基因組水平上，比較分析了已登錄GcnBank的19種龜鱉類線粒體全基因組的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明：1)除平胸龜、扁陸龜外，其余17種龜鱉類線粒體基因組結(jié)構(gòu)、基因排列順序均與典型的脊椎動(dòng)物相似，顯示龜鱉類線粒體基因組在進(jìn)化上十分保守：2)19種龜鱉類線粒體全基因組和各部分的堿基組成均表現(xiàn)出高AT、低G含量的偏向，在控制區(qū)中表現(xiàn)尤為明顯：3)除中華鱉和白腹攝龜外，其余種類的某些蛋白編碼基因中都存在一個(gè)或多個(gè)額外插入的核苷酸：4)除側(cè)頸龜亞目的非洲側(cè)頸龜外，其余18種曲頸龜線粒體DNA的“wANCY”區(qū)中都存在輕鏈復(fù)制起始點(diǎn)(O_L)，且它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)、核苷酸組成高度保守，推測該結(jié)構(gòu)可能是曲頸龜亞目的一個(gè)共同特征：5)部分龜鱉類線粒體基圍組控制區(qū)3′端存在大片段(200～450bp)的重復(fù)序列，某些龜鱉類中有由(AT)構(gòu)成的微衛(wèi)星序列，并且這些拷貝序列在種間表現(xiàn)出一定的差異，其可作為特異的分子標(biāo)記，對(duì)于龜鱉類動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)的研究、親緣關(guān)系的鑒定、物種多樣性的保護(hù)和研究等方面具有重要的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：19種龜鱉類；線粒體全基因組；基因組結(jié)構(gòu)；控制區(qū)；串聯(lián)重復(fù)序列

中圖分類號(hào)：Q959.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007－7847(2007)03－0258－05

龜鱉類出現(xiàn)在距今約2億多年前的二疊紀(jì)至三疊紀(jì)期間，是地球上最特化、最古老的一支爬行動(dòng)物，享有“活化石”的美譽(yù)，在脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)演化史上具有重要的地位，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界現(xiàn)存龜鱉類動(dòng)物約有13科、89屬、270余種，被分為兩個(gè)特征明確的支系——側(cè)頸龜亞目和曲頸龜亞目，由于自然或人為的生存環(huán)境的破壞以及人類的食物和醫(yī)藥利用等因素，使現(xiàn)有的龜鱉類物種面臨嚴(yán)重的危脅，野生數(shù)量日趨枯竭：而龜鱉類動(dòng)物屬于長壽、晚熟、繁殖率低的類群，因此，為了保護(hù)野生動(dòng)物并持續(xù)利用龜鱉資源，加強(qiáng)對(duì)龜鱉類動(dòng)物的研究很有必要。

脊椎動(dòng)物線粒體基因組是共價(jià)閉合的雙鏈DNA，大小約15～20kb，由于具有結(jié)構(gòu)簡單、很少受到序列重排的影響、呈母系遺傳等特點(diǎn)，近年來線粒體基因組DNA(mtDNA)成為研究動(dòng)物進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育的重要分子材料，同樣受到愈來愈多的龜鱉類動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)研究者的青睞，至2007年4月，GenBank中公開發(fā)表的龜鱉動(dòng)物線粒體基因組全序列共有17種，在這17種中，側(cè)頸龜類僅非洲側(cè)頸龜(Pelomedusa subrufa)1種，曲頸龜類16種，其中包括：陸龜科(Testudinidae)10種，鱉科(Trionychidae)2種，淡水龜科(Geoemydidae)、龜科(Emydidae)、海龜科(Cheloniidae)、平胸龜科(Platysternidae)各1種。

本文擬對(duì)這17種龜鱉類結(jié)合我們近期測定的鋸緣攝龜(Pyxidea mouhotii)和白腹攝龜(Cy-clemys atripons)的mtDNA全序列(另文待發(fā)表)共19種龜鱉類，在基因組水平上進(jìn)行了比較研究，以期探討龜鱉類動(dòng)物線粒體的基本特征。

1 19種龜鱉類動(dòng)物的線粒體基因組比較分析

1．1 基因組結(jié)構(gòu)和基因排布

已測定19種龜鱉類動(dòng)物的線粒體基因組全長在16455～19438bp之間，其中最長的是緣翹陸龜Testudo marginata，其次是平胸龜Platyster-non megacephalum，最短的是黑凹甲陸龜Manouria emys，除平胸龜和扁陸龜有兩個(gè)控制區(qū)和其它一些特異性外，其余17種龜鱉類的線粒體基因組結(jié)構(gòu)和基因排列順序均與典型脊椎動(dòng)物的相似，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tR-NA基因、2個(gè)rRNA基因和1個(gè)非編碼基因控制區(qū)(control region)(詳見圖1)。

多數(shù)龜鱉類線粒體基因組的基因排布較為緊湊，但一些物種中也存在特異的間隔序列：中國平胸龜mtDNA中存在3段大于150bp的基因間隔區(qū)：非洲側(cè)頸龜中ND5和ND6基因間間隔124bp；鋸緣攝龜和白腹攝龜中ND4和tRNAX~基因間間隔分別為13bp、12bp，此外，類似于典型脊椎動(dòng)物，多數(shù)龜鱉類線粒體基因組中，ATP8/ATP6，ND4L/ND4和ND5/ND6基因間分別有10bp、7bp和5bp的序列重疊，非洲側(cè)頸龜和錦龜中ATP8／ATP6基因則重疊31bp。

1．2 堿基組成

19種龜鱉類動(dòng)物的線粒體全基因組、13個(gè)蛋白編碼基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因和控制區(qū)的部分堿基組成見表1，比較發(fā)現(xiàn)：這19種動(dòng)物的堿基組成相似；4種堿基中G含量最少，A+T含量相對(duì)較高，而且在控制區(qū)中這種偏向表現(xiàn)尤為明顯，這種現(xiàn)象與鳥類等脊椎動(dòng)物類似：在核苷酸組成上偏好于AT編碼。

1．3 編碼蛋白基因

19種龜鱉類線粒體基因組中，除非洲側(cè)頸龜有一個(gè)推測的ND4L基因外，其余的均可確定有13個(gè)編碼蛋白基因，且序列長度較為保守，13個(gè)編碼蛋白基因的起始密碼子可分為3類：編碼甲硫氨酸(Met)的ATR：ATG和ATA，編碼異亮氨酸(Ile)的ATC和編碼纈氨酸(Val)的GTG，共4種，其中ATG使用頻率最高，GTG為多數(shù)龜鱉類COI基因的起始密碼子；終止密碼子也可分為3類：AGR(AGG和AGA)，TAR(TAG和TAA)和不完全的T或TA，共6種，其中最常用的是TAA，不完全終止子(T或TA)在后生動(dòng)物線粒體基因組中很常見，推測可由轉(zhuǎn)錄后3′端“A”補(bǔ)齊轉(zhuǎn)化為完全的終止子TAA，此外，類似于鳥類等脊椎動(dòng)物，龜鱉類線粒體基因組的密碼子使用基本符合“擺動(dòng)學(xué)說”，在密碼子第3位點(diǎn)上變異較大，而且在堿基的選擇上更趨向于“A”。

中國平胸龜不僅在ND3基因的174位點(diǎn)存在一個(gè)額外插入的胞苷酸(C)，且NDl基因中3個(gè)不同位點(diǎn)各存在一個(gè)插入的核苷酸(2個(gè)腺苷酸“A”和1個(gè)胸苷酸“T”)；非洲側(cè)頸龜除ND3基因有一個(gè)額外插入的腺苷酸(A)外，在推測的ND4L基因的兩個(gè)不同位點(diǎn)也分別插入了一個(gè)腺苷酸(A)和一個(gè)胸苷酸(T)；其余多數(shù)龜鱉類mtDNA僅ND3基因的第174位點(diǎn)存在一個(gè)額外插入的腺苷酸(A)，一般認(rèn)為，這些額外插入的單核苷酸在翻譯過程中不表達(dá)，可能通過RNA編輯來恢復(fù)基因的功能，從而避免移碼突變導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)譯提前終止，此外，通過分析目前的19種龜鱉類mtDNA序列發(fā)現(xiàn)，這種核苷酸插入形成終止移碼框的現(xiàn)象在中華鱉和白腹攝龜中不存在，因此，這種現(xiàn)象是否是龜鱉類的一個(gè)共同特征，還是具有一定的種屬特異性，以及具體的形成機(jī)制和作用，尚有待于進(jìn)一步的研究。

1．4 輕鏈復(fù)制起始點(diǎn)(O_L)

除側(cè)頸龜亞目的非洲側(cè)頸龜外，已測的所有曲頸龜亞目mtDNA的tRNA^Trp-tRNA^Ala-tRNAa^Asn-tRNA^Cys-tRNA^Tyr(WANCY)基因簇區(qū)的tRNAA^Asn和tRNA^Cys之間都包含一個(gè)典型的“莖一環(huán)”(stem-loop)結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)在蛇類、魚類和兩棲類等很多脊椎動(dòng)物中也有報(bào)導(dǎo)，這個(gè)區(qū)域被認(rèn)為是L鏈的復(fù)制起點(diǎn)O_L(the origin ofliCht-strand replica-tion)，圖2給出目前已測mtDNA全序列的曲頸龜6個(gè)科(每科選取一個(gè)代表物種)O_L的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過比較分析已知曲頸龜亞目mtDNA的O_L序列發(fā)現(xiàn)，它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似，核苷酸組成高度保守，進(jìn)一步地，其O_L中莖上存在9bp的序列完全相同，由此推測，該結(jié)構(gòu)可能是曲頸龜類的一個(gè)共同特征，但能否作為曲頸龜亞目和側(cè)頸龜亞目的分類依據(jù)，尚需更多的龜鱉類線粒體基因組的測序研究。

1．5 控制區(qū)序列

動(dòng)物mtDNA可分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)，非編碼區(qū)即主要為線粒體基因組的控制區(qū)(control re-gion)或稱D-Loop區(qū)，它是mtDNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位，對(duì)mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用，同時(shí)是mtDNA基因組中序列和長度變異最大、進(jìn)化速率最高、最具多態(tài)的區(qū)域，控制區(qū)的這種變異在進(jìn)化上相對(duì)保守的龜鱉類動(dòng)物中也得到很好的體現(xiàn)，已測19種龜鱉mtDNA全序列中，除扁陸龜、平胸龜出現(xiàn)控制區(qū)雙拷貝外，其余的皆為單拷貝控制區(qū)，其中最長的是緣翹陸龜3943bp，最短的為黑凹甲陸龜948bp，長度變異較大，控制區(qū)長度差異是造成線粒體全基因組長度差異的主要原因。

控制區(qū)長度和序列組成在脊椎動(dòng)物各類群即便是親緣關(guān)系較近的物種中變異也較大，如：目前已測mtDNA全序列的3種親緣關(guān)系較近的淡水龜：烏龜、鋸緣攝龜和白腹攝龜，其控制區(qū)長度在981～1316bp之間，依據(jù)堿基組成和變異程度，可以將其劃分為3個(gè)區(qū)：domainⅠ～Ⅲ，其中domainⅡ區(qū)(中央保守區(qū))序列相對(duì)保守，位于F-box和CSBl間，而domainⅠ和domainⅢ區(qū)堿基變異程度較大，為遺傳上的高變區(qū)，此外，脊椎動(dòng)物3個(gè)短的保守區(qū)(CSBO_1～3)在3種淡水龜控制區(qū)的domainⅢ中也存在，3種淡水龜控制區(qū)序列差異最為顯著的是domainⅢ區(qū)的3′端含有大量的串聯(lián)重復(fù)序列，包括僅由A和T構(gòu)成的短序列的拷貝，具體表現(xiàn)為：在烏龜中存在(ATATATC)7bp單元間隔重復(fù)14次，且3′端緊接(AT)_％8微衛(wèi)星序列；鋸緣攝龜中為(ATTATATC)8bp的單元直接重復(fù)36次。而且緊鄰3’端為(AITATATr)8bp的單元間隔重復(fù)13次；白腹攝龜中僅有[A(AT)₃]單元直接重復(fù)15次的微衛(wèi)星序列。前面沒有其它的重復(fù)序列拷貝，3種淡水龜控制區(qū)3′端的重復(fù)拷貝序列，特別是由AT構(gòu)成的微衛(wèi)星序列拷貝也出現(xiàn)于其它的一些龜鱉類線粒體基因組中，Zardoya和Meyer(1998)曾報(bào)道在非洲側(cè)頸龜控制區(qū)3′端存在453bp長的重復(fù)序列，由6個(gè)直接拷貝序列構(gòu)成且每個(gè)拷貝序列3′端緊接(TA)_10-11微衛(wèi)星序列，最為特殊的是3，端鄰接tRNA^phe基因的微衛(wèi)星序列較長：由7個(gè)TAA(TA)_3-4單元構(gòu)成，此外，通過比較分析，我們發(fā)現(xiàn)控制區(qū)3′端大片段的重復(fù)拷貝序列(200～450bp)，包括由AT構(gòu)成的微衛(wèi)星DNA序列，除在已知的非洲側(cè)頸龜和3種淡水龜中存在外，在馬來亞鱉、錦龜、綠海龜中表現(xiàn)也較為明顯，但是，不同的物種中重復(fù)單元的核苷酸組成和重復(fù)次數(shù)不同，這些可作為特異的分子標(biāo)記，對(duì)于龜鱉類動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)的研究、親緣關(guān)系的鑒定、物種多樣性的保護(hù)和研究等方面具有重要的參考價(jià)值。

2 龜鱉類mtDNA的研究展望

目前，絕大多數(shù)龜鱉類動(dòng)物mtDNA全序列尚未測定，已測的還不到物種總數(shù)的10％，這對(duì)于精確的龜鱉類系統(tǒng)學(xué)研究顯然是有限的，mtD-NA研究已逐漸轉(zhuǎn)向大批量的測定全序列及其與核DNA結(jié)合共同研究物種的系統(tǒng)進(jìn)化。

龜鱉類動(dòng)物mtDNA控制區(qū)中發(fā)現(xiàn)大量的串聯(lián)重復(fù)序列，且在種間表現(xiàn)出一定的差異，以此為基礎(chǔ)研究龜鱉類的線粒體異質(zhì)性和mtDNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及動(dòng)物特異的分子標(biāo)記等，此外，有些龜鱉類，特別是一些雜交種，如：鋸齒黃額閉殼龜(Cuora serrata)、缺顎花龜(Ocadia glyphistoma)、菲律賓花龜(Ocadia philippeni)、艾氏擬水龜(Mauremys iversoni)、臘戌擬水龜(Mauremyspritchardi)，其產(chǎn)生機(jī)理和分類地位尚未清楚，這些都有待于進(jìn)一步的研究。

作者簡介：張莉(1979－)，女，安徽蒙城人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物細(xì)胞與分子生物學(xué)研究；

聶劉旺(1962－)，男，安徽潛山人，安徽師范大學(xué)教授，博士，通訊作者，主要從事動(dòng)物遺傳與分子生物學(xué)研究。