人ｓＴＮＦＲ１基因原核表達(dá)及體外抗肝細(xì)胞凋亡的活性研究

彭仕芳 傅 蕾 譚德明 候周華 劉洪波

摘要：采用RT-PCR，從Hela細(xì)胞的mRNA中擴(kuò)增人STNFR1基因，構(gòu)建含有目的片段的T載體克隆及原核表達(dá)載體pMAL-c2x重組質(zhì)粒亞克隆，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，測序證實(shí)其序列與基因數(shù)據(jù)庫中STNFRl基因一致，經(jīng)異丙基，-β-D半乳糖苷酶(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，淀粉樹脂親和層析法純化，得到融合蛋白STNFR1-MBP，結(jié)果顯示：經(jīng)Western-blotting檢測，STNFR1-MBP具有免疫活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測目的蛋白對TNF-α誘導(dǎo)QSG7701凋亡有抑制作用，這為今后的研究打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：人STNFRl；原核表達(dá)；抗肝細(xì)胞調(diào)亡

中圖分類號：R575.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)02-0147-06

腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor α，TNFα)是由單核，巨噬細(xì)胞分泌的具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，能誘發(fā)肝細(xì)胞壞死和凋亡，其過度表達(dá)是肝功能衰竭發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要因素，TNFα生物學(xué)作用通過特異性受體介導(dǎo)，而TNFα的可溶性受體(STNFR1)可中和TNFα的毒性作用，為有效抑制TNFα所誘發(fā)的細(xì)胞毒作用以及治療肝功能衰竭，本研究從克隆STNFR1基因、構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒人手，獲得了具有生物學(xué)活性的重組蛋白sTNFR1-MBP，為進(jìn)一步研究該蛋白在肝功能衰竭的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株、菌種與質(zhì)粒

QSG7701人非致瘤性肝細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理教研室所贈，JM109由我室保存，pGEM-T載體購自Promega公司，表達(dá)載體pMAL-c2x購自NEB公司。

1.1.2酶及主要試劑

TaqDNA聚合酶、rr4DNA連接酶、Sal I、EcoR I購自TakaRa公司，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和WFG購自Promega公司，DNA凝膠純化試劑盒購自QIA-GEN公司，淀粉樹脂購自NEB公司，麥芽糖購自Sigma公司，Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑購自生物晶美公司，TNF-a、兔抗人STNFR1多克隆抗體購自PEPROTECH公司，Western blotting檢測試劑盒購自博士德公司，TRIzol Reagent RNA分離液、DMEM(高糖)、新生牛血清購自美國GIBCOBRL公司產(chǎn)品，放線菌素-D購自北京夏斯生物公司，常用試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3儀器

核苷酸測序使用ABl377全自動測序儀及配套的BigDye Terminator試劑盒測序，由博亞公司完成；流式細(xì)胞儀(FCM)為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 RT-PCR擴(kuò)增sTNFR1目的片段

PCR引物參照人可溶性腫瘤壞死因子受體1(sTNFR1)cDNA全序列設(shè)計(jì)，由上海博亞公司合成，上下游引物5′分別加入Sa/I和EocR I酶切位點(diǎn)，上游引物：5′－GAA TCC ATG GAT AGTGTG TGT CCC C-3′；下游引物：5′-GTC GAC GGATCC TCA AAT GAT CAG GGG CAA C-3′，按TRI-zol說明書自Hela細(xì)胞中提取總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增sTNFR1基因，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照MMLV逆轉(zhuǎn)酶說明書進(jìn)行：取總RNA 3μg，oligo(18)0.5μg，加DEPC水至總體積12μL，70℃5 min后，立即置于冰上；然后加入5xRT Buffer 5μL，dNTP 12.5 nmol，RNA酶抑制劑25U，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U，加DEPC水至總體積25μL，42℃60 min逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物為cDNA，PCR反應(yīng)體系為DNA2μL。TaqDNA聚合酶0.5u，10xBuffer(Mg²⁺)5L，10mmol/L dNTP₃4μL，人sTNFR1引物各25pmo1，加雙蒸水至總體積50μL l.PCR條件：95℃5min預(yù)變性，94℃40 s變性，55 qC 40 s退火，72℃lmin延伸，32個循環(huán)后，72℃延伸15min，

1.2.2構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒

PCR產(chǎn)物純化后，首先應(yīng)用T載體克隆，然后從重組的“T”質(zhì)粒DNA中，應(yīng)用Sal I、EocR I雙酶切出sTNFR1基因片段，與用相同酶切后的pMAL-c2x質(zhì)粒DNA連接重組，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌JM109，挑取陽性克隆，接種于含有100mg／L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)過夜生長，提取質(zhì)粒，Sal I和EocR I雙酶切分析，并且核苷酸測序證實(shí)。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

挑選經(jīng)測序驗(yàn)證的陽性克隆菌放入含有100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，用異丙基β－D－半乳糖苷酶(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，參照文獻(xiàn)[7]找出重組蛋白最佳的表達(dá)條件：26℃，0.06 mmol/L IPIG，200r/min，將轉(zhuǎn)化菌在含有100mg/L氨芐青霉素的LB中過夜生長，次日以1：100接種于含100mg/L氨芐青霉素的LB，37℃振蕩生長至吸光度值A(chǔ)600=0.5，加IPTG至0.06 mmol/L.26℃繼續(xù)振蕩6h，離心收集誘導(dǎo)后的菌體，超聲裂解細(xì)菌，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析表達(dá)的重組蛋白。

1.2.4重組蛋白的純化

取200～500mL含有100mg／L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基增菌后，在最佳表達(dá)條件下誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體超聲破碎細(xì)菌，5000g離心30min，收集上清，將上清以1：4比例稀釋上淀粉樹脂層析柱，并用10mmol/L麥芽糖洗脫融合蛋白，將所得純化蛋白SDS-PAGE分析。

1.2.5 Western-blotting檢測重組蛋白

全菌體裂解液經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(同時有空菌和空質(zhì)粒作為對照)，4℃轉(zhuǎn)移電泳70rain，100V恒壓，轉(zhuǎn)膜完畢經(jīng)麗春紅染色可見有目的蛋白條帶，TBS洗滌兩次，用含5％脫脂奶粉的TBST37℃封閉1h，將PVDF膜與兔抗人STNFR1多克隆抗體(濃度0.1mg/L)溫育2h，TBST洗滌5minx3后，與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1：3000)室溫孵育1h，TBS洗滌10minx3，0.1mL/cm₂量加ECL發(fā)光試劑，暗室內(nèi)曝光x光膠片，常規(guī)方法顯影、定影。

1.2.6重組蛋白抗凋亡的體外實(shí)驗(yàn)

1)TNF-a誘導(dǎo)QSG7701細(xì)胞凋亡，檢測重組蛋白STNFR1-MBP抗凋亡作用，QSG7701細(xì)胞按2x10/mL的濃度接種6孔板中續(xù)養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90％-95％滿，備用，STNFR1-MBP 40mg/L與10μ/L的TNF-α4℃反應(yīng)2h，再加入QSG7701細(xì)胞培基中，并加入1mg/L放線菌素D；設(shè)MBP為對照組(加MBP、TNF-a和放線菌素D)以及正常組(只有QSG7701細(xì)胞，不加TNF-α和放線菌素D)，每組設(shè)3個復(fù)孔，在37℃，5％CO₂及飽和濕度條件下，培養(yǎng)6h收集細(xì)胞。

2)Anexin－V－FITC染色：a)將待測細(xì)胞用0.25％胰酶消化，制成單個懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5～1×10₆/L；b1取1 mL細(xì)胞，1000r/min 4℃離心10min；c)加入1mL冷的PBS，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮；d)1000r/min 4℃離心10 min，棄上清液；e)重復(fù)步驟c)、d)兩次；f)用去離子水按1：4稀釋結(jié)合緩沖液，將細(xì)胞重懸于250μL結(jié)合緩沖液，并使其濃度為lx10₆/L；g)取100μL的細(xì)胞懸液于5mL流式管中，加入μL Annexin-V-FITC和10μ20mg/L的PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min；h)加入400μL結(jié)合緩沖液，立即上機(jī)(流式細(xì)胞儀)檢測，光源為488 nm的氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光。

2 結(jié)果

2.1STNFR1基因片段純化和pMAL-c2x-STN-FR1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

從Hela細(xì)胞的mRNA中通過RT-PCR成功地?cái)U(kuò)增了558bp大小的基因片段，通過基因重組技術(shù)得到陽性克隆，并經(jīng)酶切分析和DNA測序證實(shí)獲得了含有STNFRl基因片段的人重組pMAL-c2X-STNFR1克隆。

2.2重組蛋白的表達(dá)與純化

將重組基因工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后對全菌裂解液進(jìn)行SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量的為66 kD處出現(xiàn)對照菌沒有的一條粗蛋白帶，與STNFR1融合蛋白相對分子質(zhì)量一致，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組基因工程菌，超聲波裂解后用淀粉樹脂親和層析法分離純化，得到了高純度的重組融合蛋白。

2.3 Western-blotting檢測重組蛋白

將轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的STNFR1重組蛋白與兔抗人STNFR1多克隆抗體反應(yīng)后，與酶標(biāo)記的羊抗兔IgG反應(yīng)后，ECL顯色，曝光，膠片上可見一條帶，其位置與目的蛋白帶一致，而對照菌JM109及pMAL-c2x/JM109均未見顯色反應(yīng)。

2.4重組蛋白抗凋亡的體外實(shí)驗(yàn)

流式細(xì)胞儀分析，獲得4個象限的直方圖，每個象限的細(xì)胞數(shù)目就是在檢測細(xì)胞總數(shù)所在點(diǎn)的組分，左下象限代表正常細(xì)胞(An-PI-)，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞(An+PI-)，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞(An+PI+)，左上象限代表細(xì)胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞(An-PI+)，可見STNFR1，MBP組凋亡率低于對照組，有顯著性差異(P<0.05)，MBP組與對照組凋亡率無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

大量研究表明，腫瘤壞死因子α(tumor necro-sis factors，TNFα)所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡在肝功能衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，TNFα生物學(xué)功能是通過與細(xì)胞表面膜受體(TNFR1和TN-FR2)的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的，可溶性TNFR(sTNFR)游離在血液中，它可與TNFa結(jié)合，但無法介導(dǎo)TN-Fet的信號傳導(dǎo)，從而可拮抗TNFα的生理作用，有研究表明，們，血漿STNFRl水平隨TNFa水平升高而升高，但其水平相對于TNFa水平是不足的，因此，應(yīng)用STNFR1抑制TNFα所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，在治療肝功能衰竭中有著潛在的重要意義，這一點(diǎn)在其他疾病中也得到證實(shí)，盡管sTNFR1屬內(nèi)源性物質(zhì)，但從體液中直接提取sTNFR1的量有限，難以滿足臨床治療的需要，利用基因工程的方法生產(chǎn)sTNFR1有深遠(yuǎn)的研究和應(yīng)用價值。

本研究從人Hela細(xì)胞提取總RNA，通過RT-PCR獲得sTNFR1全編碼的基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMAL-c2x-sTNFR1亞克隆，經(jīng)酶切及核苷酸測序，證實(shí)獲得pMAL-c2x，STNFR1重組基因工程菌，與Loetscher等報告的序列比較，結(jié)果完全一致，無移碼突變，STNFR1序列正確地插入到了MBP序列之后保證了STNFR1蛋白的正確表達(dá)，真核蛋白在原核細(xì)胞中表達(dá)面臨一個問題，就是它可能會被原核細(xì)胞中的蛋白酶識別降解，采用融合蛋白表達(dá)可解決這一問題，本實(shí)驗(yàn)采取的oMAL-c2x是在大腸桿菌中克隆的融合蛋白表達(dá)載體，其含有大腸桿菌malE基因，編碼麥芽糖蛋白(MBP)，在malE和LaZα之間含有多克隆位點(diǎn)，克隆的基因插入malE下游，通過強(qiáng)啟動分子tac和malE翻譯的起始信號產(chǎn)生克隆基因的高效表達(dá)，由于其核蛋白與上游的原核蛋白MBP融合，起到了有效的保護(hù)作用，且可通過淀粉樹脂醇親和層析法純化MBP融合蛋白，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，目的基因在大腸桿菌JM109中表達(dá)，經(jīng)SDS·PAGE蛋白電泳檢測誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的含pMAL-c2x空載體的JM109菌在43 kD位置有一蛋白帶，這是空載體產(chǎn)生的MBP蛋白帶，誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的JM109在66 kD處出現(xiàn)一蛋白帶，而JM109宿主菌、未誘導(dǎo)pMAL-c2x空質(zhì)粒的JM109和未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109菌均無此帶，證明此蛋白的出現(xiàn)是由帶有sTNFR1基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白，而且該蛋白的相對分子質(zhì)量與目的融合蛋白預(yù)計(jì)的相對分子質(zhì)量一致，經(jīng)Western-blotting鑒定，該蛋白能與sTNFR1特異性抗體起結(jié)合，證實(shí)該蛋白具有sTNFR1的免疫活性，因此證明本研究已成功的克隆表達(dá)出sTNFR1-MBP融合蛋白并進(jìn)一步得到了高純度的sTNFR-MBP。

TNF-α對正常肝細(xì)胞無明顯毒性作用，只有與氨基半乳糖和放線菌素D等合用才顯示出明顯的毒性作用，放線菌素D一方面可抑制TNF，α誘導(dǎo)產(chǎn)生的兩種保護(hù)性蛋白質(zhì)(P39和P42)：另一方面可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所需蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯，參與肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生，本研究采取TNF-α和放線菌素D誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死，應(yīng)用以熒光素FITC標(biāo)記Annexin—V作為探針，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，觀察sTNFR1-MBP對抗TNF-α誘導(dǎo)QSG7701細(xì)胞的細(xì)胞凋亡作用，研究結(jié)果示sTNFR1-MBP組凋亡率為22.62+1.22％，低于對照組70.50+4.74％，有顯著性差異(P<0.05)，說明重組的融合蛋白sTN-FR1-MBP有明顯的抑制TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)，為將sTNFR1作為靶點(diǎn)治療肝功能衰竭的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。