人干擾素ＩＦＮα－２ｂ在果蠅細胞中的穩(wěn)定表達

摘要：以人干擾素IFN-2b全長基因的質粒為模板，PCR擴增，PCR產物克隆到表達載體獲得重組質粒，經轉染和篩選，得到穩(wěn)定表達的果蠅S2細胞株，經CuSO₄誘導表達并對表達產物進行檢測，結果顯示，在果蠅S2細胞中成功地進行了人干擾素IFNα-2b的蛋白表達，表達產物的大小約為26kD，并且，通過體外的抗病毒活性測定，證明所表達蛋白具有抗病毒活性，該研究為進一步利用該系統(tǒng)表達真核細胞蛋白，研究其結構和功能提供了重要的基礎。

關鍵詞：人干擾素IFNα-2b；果蠅S2細胞；果蠅表達系統(tǒng)；穩(wěn)定表達

中圖分類號：R373

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)02-0143-04

干擾素(Interferon，IFN)是對病毒感染和其它抗原刺激應答所產生的一組宿主蛋白，根據(jù)產生干擾素細胞來源不同，理化性質和生物學活性的差異，可分為α，β，γ 3類，分別屬于I型(α、β)和II(γ)型干擾素，目前認為I型(α、β)型干擾素的抗病毒作用優(yōu)于II(γ)型干擾素，而II(γ)型干擾素的抗腫瘤及免疫調節(jié)功能優(yōu)于I型(α、β)型干擾素，果蠅s2細胞系來源于黑腹果蠅(Droso-ohila melanogaster)晚期胚胎的培養(yǎng)物，該細胞系的許多特征揭示其來源于巨噬細胞樣細胞系，果蠅S2細胞可在28℃或室溫無CO₂條件下生長，其在組織培養(yǎng)瓶中以松散，半貼壁的單層狀態(tài)生長或在搖瓶中以懸浮狀態(tài)生長，

果蠅表達系統(tǒng)(Drosophila expression system)DES包含表達載體(pMT/BiP/V5-His A)和相應的選擇載體(pCoHygro)，通過表達載體和選擇載體的共轉染，可在3～4周時間內獲得表達重組蛋白的穩(wěn)定轉染的細胞系，而且通過優(yōu)化表達載體和選擇載體的比例，可以得到含有高拷貝數(shù)目的基因的細胞系，從而提高目的蛋白的表達量。

人干擾素IFNα-2b具有許多生物學作用，包括廣譜的抗病毒作用，抑制腫瘤細胞增殖和增強免疫的功能，這些使得它成為治療腫瘤性疾病，癌癥和肝炎的潛在制劑，干擾素制劑有自然的和重組的兩類，臨床應用的干擾素主要是從大腸桿菌中獲得的基因重組蛋白，而果蠅表達系統(tǒng)是非常出色的真核表達系統(tǒng)，有許多獨特的優(yōu)勢，如比哺乳動物表達系統(tǒng)更高的表達量，簡單的高密度細胞培養(yǎng)，可減少降解的分泌性表達等，我們嘗試研究一下干擾素在這一系統(tǒng)中的表達情況。

1材料與方法

1.1果蠅S2細胞系(Schneider 2 Cells)，Wish細胞和VSV病毒

果蠅S2細胞系由健康科學研究所戈寶學研究員惠贈，用DES完全培養(yǎng)液培養(yǎng)于28℃無CO₂的細胞培養(yǎng)箱中，其中DES完全培養(yǎng)液的構成為：DES培養(yǎng)液(HyClone公司)，10％胎牛血清(Gibco公司)，2mmol/LL-谷氨酰胺(Calbiochem公司)，100U/mL的青霉素和0.1g/L的鏈霉素。

DES Expression Vectors包含將感興趣的目的基因克隆進去的表達載體(Expression vector)pMT/BiP/V5-HisA和一個相關的選擇載體(Se-lection vector)pCoHygro，這些載體購自Invitrogen公司。

Wish細胞和VSV病毒由上海復興公司提供，Wish細胞的培養(yǎng)條件是，用含10％胎牛血清(Gibco公司)的RPMI－1640(HyClone公司)培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃有CO₂的細胞培養(yǎng)箱中，干擾素的標準品由上海復興公司提供，以用作抗病毒活性測試中的對照。

其它主要試劑：小量質粒抽提及膠純化回收試劑盒購自Qiangen公司，rr4 DNA連接酶及限制性內切酶EcoR I，Not I購自Takara公司，一抗小鼠抗人IFNα的單克隆抗體購自RD公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自Sigma公司。

1.2人干擾素IFNα-2b表達載體的構建

含有人干擾素IFNα-2b全長基因的質粒由上海志壯生物科技有限公司合成，為克隆至pMT/BiP/V5-His A表達載體，根據(jù)IFNα-2b基因序列，設計了兩個引物，分別是：5′端GTGGAATTC-TATGTGTGACT-FGCCACA(斜體為引入的酶切位點EcoR I)，3'ATAGCGGCCGCAACTCCTFAGATCTCAAAGA(斜體為引入的酶切位點Not I)，所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，

以含有人干擾素IFNα-2b全長基因的質粒為模板，PCR擴增，PCR產物克隆到pMT/BiP/V5-His A獲得重組質粒pMT/BiP/V5-His A-IFNα-2b。

1.3果蠅S2細胞的穩(wěn)定轉化與篩選

果蠅S2細胞的轉化方法部分參照文獻，吸取含3×10⁶ S2細胞的完全培養(yǎng)液，接種于35mm細胞培養(yǎng)板，28℃無CO₂培養(yǎng)6～16h，直到細胞達到對數(shù)生長期(2～4×10⁶/mL)，對于每一個35mm細胞培養(yǎng)板，準備轉染試劑如下：A液(2mol/LCaC|₂36μL，重組DNA 19μg，pCoHygro 1μg，加去離子水至300μL)，B液(300μL 2xHBS)，逐滴緩慢將A液加入B液中，并持續(xù)搖動混勻，將所得溶液于室溫孵育30～40 min，至形成沉淀，混勻溶液并逐滴加人細胞培養(yǎng)板中，28℃無CO₂培養(yǎng)16～24h。

為篩選得到果蠅s2細胞穩(wěn)定轉染的細胞系，先去除磷酸鈣，并用完全培養(yǎng)基將細胞洗兩次，離心，重懸細胞于含300 mg/L抗生素HygromycinB的新鮮培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)，每4～5d更換抗性培養(yǎng)液，直到抗性細胞克隆產生(需3～4周)。

1.4誘導表達與Western-blotting分析

穩(wěn)定表達的細胞系建立后，使用第3代細胞誘導表達，加入硫酸銅至終濃度為500μmol/L24h后收獲細胞，收集細胞培養(yǎng)上清，經真空低溫濃縮后，對表達產物進行Western blotting分析

參照Bio-Rad公司半干轉印儀操作說明進行電轉印，然后進行免疫檢測，將麗春紅染色后的PVDF膜(Millipore公司)轉移至封閉液(含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液)中，室溫輕搖1～2 h后4℃封閉過夜；倒掉封閉液，用TBST(100 mmol/LTris-HCl，pH 7.5，150mmol/LNaCl)洗膜3次，每次10min，然后加入以封閉液1：1000稀釋的一抗，室溫下震蕩1～1.5h；再用TBST洗膜3次，每次10min，然后加入以封閉液1：5000稀釋的二抗，室溫下震蕩1～1.5 h；再用TBST洗膜3次，每次10min，最后用ECL(Pie0rce公司)顯色，在x光膠片上曝光，顯影和定影觀察，

1.5體外抗病毒效價測定

VSV病毒的繁殖及效價的測定方法參照文獻描述，VSV病毒經1：10稀釋后接種于形成單層的Wish細胞，37℃培養(yǎng)24～48h，待細胞出現(xiàn)病變(CPE)達+++～++++時收獲，于-20℃凍存；采用常用的微量細胞病變法測定病毒的效價，其效價(TCID50)為10^-6／mL；“+”為25％細胞出現(xiàn)CPE，“++”為50％細胞出現(xiàn)CPE，“+++”為75％出現(xiàn)CPE，“++++”為100％細胞出現(xiàn)CPE。

取干擾素標準品一支，稀釋成500IU／mL，然后依次對倍稀釋加人96孔板中，每孔100μL，每個稀釋度設3個復孔，表達的果蠅S2細胞上清也進行對倍稀釋，每孔100μL。

然后在各孔中均加人100μL(2×10⁵/mL)Wish細胞，37℃，5％CO₂培養(yǎng)6h后，加人100TCID₅₀的VSV病毒100μL，并設有細胞對照和病毒對照，其中細胞對照不加病毒液，病毒對照不加IFN，待細胞對照正常而病毒對照孔內出現(xiàn)+++～++++CPE時，進行效價判定。

2 結果

2.1人干擾素IFNα-2b果蠅細胞表達載體的構建

人干擾素IFNα-2b全長基因經PCR擴增，PCR產物及空表達載體pMT/BiP/V5－His A經EcoR I，Not I酶切后，回收、連接、轉化感受態(tài)細胞、抽提質粒，經酶切鑒定得到重組質粒pMT/BiP/V5－His A-IFNα-2b，其中人干擾素IFNα－2b基因為498 bp，載體pMT/BiP/V5－HisA為3600 bp，然后進行測序，測序結果表明獲得的重組表達載體的序列和插入方向完全正確。

2.2表達蛋白的免疫印跡分析

果蠅S2細胞穩(wěn)定轉染細胞系經擴增和硫酸銅誘導表達24h后，收集細胞培養(yǎng)上清3mL，經真空冷凍濃縮至100μL后，對表達產物進行Western blotting分析，蛋白轉印后，免疫印跡分析結果表明：表達蛋白能被小鼠抗人IFNα的單克隆抗體特異性識別，證明表達產物具有良好的免疫學活性。

2.3體外抗病毒效價測定

根據(jù)干擾素活性單位的定義以保護半數(shù)(50％)細胞免受病毒損害的最高干擾素稀釋度為1個干擾素活性單位，表1結果顯示表達的rhlFNot-2b具有抗病毒活性，然而其活性比標準品低8倍，根據(jù)該圖表，100μL rhlFNa-2b溶液的抗病毒活性是8Iu，所以表達的rhlFNot-2b的抗病毒活性約是80IU/mL，

3討論

果蠅S₂細胞系是理想的用于表達的細胞系，首先，非常適合低耗費而高水平的表達真核細胞蛋白，這是因為如下一些原因：在無CO₂和無血清條件下高密度培養(yǎng)；所產生的蛋白有真核細胞的翻譯后修飾；基因組可整合多拷貝的表達質粒，能夠選擇出高表達的多克隆穩(wěn)定細胞系，其次，內源性表達的果蠅細胞蛋白不與哺乳動物細胞蛋白相互作用，提供了蛋白功能研究的空白背景，

果蠅表達系統(tǒng)結合了哺乳動物表達系統(tǒng)和昆蟲表達系統(tǒng)的優(yōu)秀特征，使得融合蛋白的表達變得簡單高效，該表達系統(tǒng)主要提供了如下的便利：直接產生穩(wěn)定且高水平表達所需蛋白的昆蟲細胞系；含有可誘導啟動子的載體，非常適合細胞毒性蛋白的表達；果蠅s₂細胞，適合簡單而高密度的培養(yǎng)。

根據(jù)國外的研究，有廣泛的蛋白應用這一表達系統(tǒng)獲得了成功的表達，而這一系統(tǒng)特別適合表達的蛋白包括分泌性蛋白、細胞受體蛋白、酶和細胞毒性蛋白。

由于這些優(yōu)點，果蠅表達系統(tǒng)在國外的蛋白研究中有極為廣泛的應用，包括近年的一些蛋白研究，然而中國國內卻無相關工作的開展，在本實驗中，我們應用這一系統(tǒng)，使人干擾素IFNα-2b在果蠅細胞中穩(wěn)定表達，并具有抗病毒活性，這為進一步利用該系統(tǒng)表達真核細胞蛋白，研究其結構和功能提供了重要的基礎。