ＢＲＧ１在肺癌組織和腫瘤細胞系中表達下調原因初探

關勇軍 蔡秀梅 李友軍 何春梅 陳主初

摘要：前期的研究表明：在肺癌及多種腫瘤細胞系中，BRG1(brahma-related gene 1)的mRNA和蛋白質表達下調或缺失，但影響BRG1表達下調的原因并不清楚，因此，用PCR-SSCP(single strand conformation polymor-phism)方法檢測18例肺癌組織和15株腫瘤細胞系DNA，并經測序證實：其中有1例肺癌組織的BRG1外顯子25第3590位堿基存在T→C的點突變，其編碼的BRGI蛋白第1171位氨基酸相應地由Val(纈氨酸)→Ala(丙氨酸)，該突變位于BRG1蛋白最重要的功能區(依賴DNA的ATP酶區)，提示BRG1突變在肺癌發生中可能起一定的作用，同時，對未檢測到BRG1 mRNA表達的6例肺癌組織和9株腫瘤細胞系還進行了DNA甲基化分析，結果發現：這些肺癌組織和腫瘤細胞系中BRGI啟動子區均無異常甲基化，這說明BRG1在肺癌中表達下調的機制尚需進一步研究。

關鍵詞：BRG1；肺癌；突變檢測；甲基化分析

中圖分類號：R730

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)02-0153-05

BRG1(fbrahma-related gene 1)是進化上高度保守的SWI/SNF染色質重塑復合物的成員之一，我們和其他人的研究均發現：在肺癌組織及多種腫瘤細胞系中，BRGI的mRNA與蛋白質表達下調或缺失，但影響BRGl在肺癌中表達下調的原因仍不清楚，我們采用PCR和PCR-SSCP方法對肺癌組織和多種腫瘤細胞系進行檢測，為闡明BRG1在肺癌中表達改變的機制提供證據。

1材料與方法

1.1細胞與組織

永生化人支氣管上皮細胞系HBE，肺鱗癌細胞系NCI-H520，肺腺癌細胞系A549，鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、HNE3、HONE1，宮頸癌細胞系Hela，喉癌細胞系Hep-2，腎癌細胞系RLC和肝癌細胞系SMMC由本室提供，18例原發性肺癌組織取自中南大學湘雅二醫院經病理確診且未經放療和化療的患者，其中肺鱗癌12例，小細胞癌3例，腺癌、腺鱗癌和大細胞癌各1例。

1.2主要試劑

Toq DNA聚合酶(大連寶生物工程公司)，限制性內切酶Msp Ⅰ和HpaⅡ(MBI公司)，蛋白酶K、SDS(Sigma公司)，小牛血清、RPMI1640培基(GIBCO公司)，胰酶、ADNA/HindⅢ和PCRmarker、瓊脂糖等(華美生物工程公司)，全部引物用Primer3軟件設計，由上海生工生物工程公司合成，引物序列和產物大小見表1.1，3方法1.3，1 DNA抽提。

細胞／組織DNA的提取參照文獻[6]的方法進行，1，3，2純合性缺失檢測。

以提取的組織和細胞系基因組DNA為模板，分別用6對引物PCR擴增STSI。6片段[7]，反應結果用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，1，3，3點突變檢測fPCR-SSCP)。

以提取的組織和細胞系的基因組DNA為模板進行PCR反應，以鼻咽癌細胞系CNE2基因組DNA為模板擴增p53基因第8號外顯子(已知CNE2細胞中p53基因外顯子8第280位密碼子存在G～C錯義突變)，作為陽性對照，PCR產物與等量變性緩沖液(97％去離子甲酰胺，0，2 mmol／L EDTA，0，05％溴酚藍，0，05％二甲苯青FF)混勻，99℃變性10 min，置冰上驟泠，迅速上樣于8％-12％的非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：雙叉丙烯酰胺=49：1，凝膠厚度0.4 mm)，4℃，200V，電泳10～12h，卸下凝膠，于固定液(10％乙醇，0.5％冰醋酸)中浸泡10min，染色液(0.2％硝酸銀)15min，蒸餾水漂洗2次，置顯色液(0.75％NaOH和0.2％甲醛)中顯色直至出現清晰的DNA條帶，玻璃紙包裹凝膠，室溫干燥保存。

1.3.4甲基化分析

甲基化分析采用Kane等描述的方法進行，已知BRGl表達下調的6例肺癌組織和9株腫瘤細胞系基因組DNA采用常規蛋白酶K消化、酚／氯仿抽提，1μg基因組DNA分別用100u的HpaⅡ或200 u的Msp I，37℃消化過夜，酶切產物純化后，取40ng純化的酶切產物用于PCR擴增，未消化的基因組DNA作對照，30μL PCR反應體系：1xPCR緩沖液、0.2 mmol／LdNTPs、1uTaq酶、0.4 txmol／L甲基化分析引物，94℃5 min預變性，94℃50 s、55℃50 s、72℃50 s，30個循環，PCR產物經2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2實驗結果

2.1純合性缺失檢測

為探討BRGl是否因純合性缺失而影響其表達，用分別針對BRG１基因內部6個STS(se－quence tagged site)的6對引物，對18例肺癌組織和15株腫瘤細胞系的基因組DNA進行了PCR擴增，結果經瓊脂糖凝膠電泳檢查，在所有檢測的肺癌組織和腫瘤細胞系中未發現有BRGl基因的純合性缺失(見圖1)。

2.2點突變檢測

同時，我們還用PCR-SSCP方法檢測了18例肺癌組織和15株腫瘤細胞系中BRG1外顯子4、7、10、19、25、26、34的點突變情況，結果發現：BRG1外顯子25的PCR產物在第16例肺癌組織標本(T₁₆)中比配對的正常肺組織標本(N₁₆)缺失一條帶(圖2)；經測序證實，該例肺癌中BRG1基因的核苷酸序列在第3590位堿基有T→C的突變(圖3)；相應的BRG1蛋白質序列第1171位氨基酸由Val(纈氨酸)→Ala(丙氨酸)，其位于BRG1最重要的功能區(依賴DNA的ATP酶區)，見圖4。

2.3甲基化分析

我們曾用RT-PCR(reverse transcription.ooly-merase chain reaction)的方法，在6例肺癌組織和9株腫瘤細胞系中未檢測到BRGl的mRNA表達，這是否由于BRG1啟動子高甲基化所致有待證實，為此，對BRG1轉錄起始點上游1kh的DNA序列(CG含量>50％、CpG／GpC>50％)講行甲基化分析，結果未發現甲基化異常(圖5)，

3討論

我們和其他人的研究均發現：在肺癌組織及多種腫瘤細胞系中，BRG1的mRNA與蛋白質表達下調或缺失，但影響BRG1在肺癌中表達下調的原因仍不清楚，值得進一步研究，腫瘤的發生是一個多基因、多步驟的復雜過程，其中癌基因的活化和抑癌基因的失活起到關鍵性的作用，已知抑癌基因可以通過突變或調控改變而失活。突變包括基因的全部或部分缺失、基因的調控區發生變異而使其mRNA不表達、基因重排及錯義、無義、移碼或剪切位點的突變導致蛋白質失活等；基因調控改變有DNA甲基化、組蛋白乙酰化、剪接異常等，

Wong等為研究BRG1是否因突變而失活篩選了大量腫瘤細胞系，他們利用分散在BRG1中的6個STS(sequence tagged site)來檢測92株腫瘤細胞系以判斷是否存在純合性缺失，結果發現BRG1在前列腺癌細胞系TSU-PRL和肺癌細胞系A-427中有羧基末端純合性缺失，在肺癌細胞系NCI-H1299中有大片段缺失，他們采用全長cDNA分段測序的方法，發現在乳腺癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌細胞系中，BRGl的外顯子4、7、10、19、25、26、34有點突變和缺失造成的移碼突變、無義突變、剪接位點改變等，這些突變影響了BRG1蛋白的表達和功能。

據此，我們用同樣的6個STS對肺癌組織及肺癌、鼻咽癌等多種腫瘤細胞系進行純合性缺失檢測，并用PCR-SSCP對BRG1的上述7個外顯子進行點突變檢測，結果在所有檢測的肺癌組織和腫瘤細胞系中未發現有BRG1的純合性缺失，但在一例肺癌組織(1/18)中檢測出有點突變，經測序發現，該例肺癌中BRG1基因的核苷酸序列在第3590位堿基有T—C的突變；相應地，BRG1蛋白質序列第1171位氨基酸由Val(纈氨酸)→Ala(丙氨酸)，突變點位于BRG1蛋白最重要的功能區(依賴DNA的ATP酶區)。

此外，考慮到BRG1表達下調可能是由于該基因啟動子區DNA甲基化所致，我們采用酶切一PCR的方法，對已知BRG1表達下調或缺失的肺癌組織及腫瘤細胞系進行該基因的5′端CpG島甲基化分析，但未發現有甲基化異常，表明BRG1的表達下調并非因為5′端DNA高甲基化所致，

最近的研究顯示，分別采用PCR直接測序和甲基化特異性PCR(methylation.specific PCR，MSP)方法，對20例有19號染色體短臂雜合性丟失(19p LOH)的原發性非小細胞肺癌(NSCLC)標本(其中15例腺癌和5例鱗癌)進行突變檢測和10株肺癌細胞系及52例肺癌組織進行DNA甲基化分析，結果發現：在所檢測的肺癌組織和細胞系中，并無BRG1啟動子的高甲基化；而在20例有19p LOH的原發性NSCLC標本中，則檢測出一例肺腺癌(1/20)有BRG1外顯子4內部24bp(第219-244位密碼子)重復引起的插入突變和另一例肺腺癌(1/20)中BRGl外顯子25第1160位密碼子Gly(甘氨酸)→Arg(精氨酸)的點突變，這與我們的研究結果類似，由此可見BRG1突變在肺癌中確實存在，不過其頻率較低；而肺癌中BRG1啟動子并無甲基化異常表現，BRG1在肺癌中表達下調的機制尚需進一步分析。