溫敏雄性核不育水稻可育花藥與不育花藥的鈣分布

邱義蘭 李 紅 陳 松 劉如石 陳良碧

摘要：用焦銻酸鹽沉淀法研究了溫敏雄性核不育水稻在減數分裂時期和單核早期可育花藥與不育花藥的鈣分布，結果表明：在減數分裂時期，可育花藥小孢子母細胞和藥室內的鈣顆粒很少，而不育花藥小孢子母細胞中分布許多的鈣顆粒，特別是藥室中的鈣顆粒異常豐富，小孢子母細胞減數分裂異常，細胞質收縮退化，在單核早期，可育花藥花粉內的鈣顆粒極少，花粉表面分布許多鈣顆粒，而不育花藥花粉內分布許多鈣顆粒，藥室內的鈣顆粒仍然非常豐富，可育花藥維管束鞘細胞體積大且形狀規則，細胞內的鈣顆粒很少，而不育花藥維管束鞘細胞體積小且形狀不規則，細胞內的鈣顆粒較多。

關鍵詞：溫敏雄性核不育；水稻；花藥；鈣

中圖分類號：S511.01

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)02-0167-05

Ca²⁺作為植物生長發育過程中的必須元素之一，通過特定的時空分布參與調控植物生長發育的諸多發育過程，許多研究表明，Ca²⁺在雄性不育中具有重要的作用，不同類型的雄性不育，其花粉敗育的方式不同，Ca²⁺的分布與作用也不同，如光敏型雄性不育的水稻與小麥，花粉敗育發生在小孢子形成大液泡以后的小孢子晚期，花粉細胞質內Ca²⁺的異常積累可能是導致花粉敗育的一個重要因素，而在花粉敗育發生在小孢子母細胞減數分裂時期的非生態類型的雄性核不育白菜中，花粉內Ca²⁺過低導致花粉敗育，溫敏雄性核不育水稻是生態型兩系不育水稻的一種，其育性轉換主要由溫度控制，不育系對溫度的敏感期是小孢子母細胞形成至單核花粉期，且花粉敗育主要發生在小孢子母細胞減數分裂時期，那么Ca²⁺在溫敏雄性核不育水稻溫度敏感時期的花藥中分布特征及其在花粉敗育中的作用如何?本研究以典型的溫敏核不育系親本培矮64S為實驗材料，用焦銻酸鹽沉淀法著重研究小孢子母細胞減數分裂時期與單核早期的可育花藥與不育花藥的鈣分布特點，為探討鈣在溫敏雄性不育水稻中花粉敗育的作用提供基礎。

1材料與方法

實驗材料為溫敏雄性核不育系水稻一培矮64S.4月底播種，幼苗長到5葉期移栽到盆中，當幼穗發育進入雌雄蕊原基形成期(幼穗長1cm左右)時，一部分植株在23℃左右、水深淹沒處于育性轉換溫度敏感期的幼穗的人工冷水池中處理12d，然后置于自然的高溫生長條件下，另一部分植株一直置于自然的高溫不育的生長條件下生長。

參照Tian等方法，分別取發育早期的高溫不育花藥和低溫可育花藥，迅速投入含2.5％戊二醛、2％焦銻酸鉀、0.1 tool/L磷酸緩沖溶液配置的前固定液中室溫下固定3h，用含2％焦銻酸鉀、0.1 mol/L磷酸緩沖液配置的洗滌液清洗3次，每次30min，材料轉入含1％鋨酸、2％焦銻酸鉀、0.1 mol/L磷酸緩沖液配置的后固定液中4℃下固定16h左右，洗滌液清洗3次，每次30min，丙酮脫水，Spurr樹脂包埋，包埋材料用LEICA切片機進行超薄切片，切片經2％醋酸鈾染色用JEMl230透射電子顯微鏡于80kV條件下觀察和拍照。

2結果與分析

2.1小孢子母細胞減數分裂時期可育花藥與不育發藥的鈣分布

在可育花藥中，減數分裂的小孢子母細胞核體積大，位于細胞中央，核顯現染色體，細胞質濃厚，細胞器豐富，在小孢子母細胞與其周圍的胼胝質壁中的鈣顆粒均很少(圖1a)，這時花藥藥壁已分化完全，由表皮，藥室內壁，中層和絨氈層4層細胞組成，表皮細胞含有一個大液泡，細胞體積大，藥室內壁細胞和中層細胞均具有大液泡，體積較少，絨氈層細胞位于藥室最內層，細胞體積較大，細胞質濃厚，表皮細胞的細胞核和細胞間隙中的鈣顆粒較多，其它三層細胞中的鈣顆粒均很少(圖1b)，這時，維管束幼嫩，尚未分化形成導管，維管束鞘細胞體積大且形狀規則，其中的鈣顆粒很少(圖1c)。

在不育花藥中，減數分裂的小孢子母細胞核位于中央，細胞質濃厚，細胞器豐富；小孢子母細胞與其周圍的胼胝質壁中均分布許多鈣顆粒，其中在藥室內的鈣顆粒非常豐富(圖1d)，隨著花粉發育，小孢子母細胞中的細胞器變得模糊不清，細胞內出現吞噬泡，細胞質收縮退化(圖1e)，在藥壁組織中，表皮、藥室內壁、中層細胞核中分布許多鈣顆粒，絨氈層細胞中的鈣顆粒較少(圖1f)，維管束幼嫩，尚未分化形成導管，維管束鞘細胞體積小且形狀不規則，其中分布少量的鈣顆粒(圖1g)。

2，2單核早期可育花藥與不育發藥的鈣分布

在可育花藥中，單核早期花粉的細胞核位于中央，核膜之間的間隙局部擴張成一大的“泡狀”物，細胞器豐富，花粉壁尚未完全形成，這時花粉細胞質中的鈣顆粒仍然非常少，而花粉表面分布許多鈣顆粒(圖2a)，在藥壁組織中，表皮、藥室內壁細胞和中層細胞均具有大液泡，細胞體積較少，絨氈層細胞徑向加厚，細胞中出現豐富的細胞器，表皮和藥室內壁細胞核中分布豐富的鈣顆粒，中層和絨氈層細胞中的鈣顆粒均很少，但絨氈層內切向壁上分布許多鈣顆粒，藥室內的鈣顆粒也很少(圖2b)，這時維管束已分化形成導管，有許多鈣顆粒分布，維管束鞘細胞體積大，鈣顆粒很少(圖2c)，

在不育花藥中，單核早期花粉與可育花藥形態相似，然而，鈣分布出現明顯的異常：花粉細胞質和細胞核中分布許多鈣顆粒，特別是核膜擴張形成的“大泡”中分布非常豐富的鈣顆粒(圖2d)，這時，表皮和藥室內壁細胞均具有大液泡，細胞核中的鈣顆粒豐富，而液泡和細胞質中的鈣顆粒較少，中層細胞中的液泡變小，細胞徑向變薄，絨氈層細胞徑向加厚，中層和絨氈層細胞中均分布一些鈣顆粒，藥室內的鈣顆粒變得非常豐富(圖2e、)，維管束鞘細胞體積小且形狀不規則，其中分布許多鈣顆粒，維管束內分化形成的導管中也有許多鈣顆粒(圖1g)。

3討論

溫敏核不育水稻屬于兩用不育系水稻，其育性表現主要受控于溫度，已有的研究表明，水稻溫敏不育系對溫度的敏感期在于小孢子母細胞形成至單核花粉期，其中減數分裂期對溫度最敏感，本研究發現，溫敏不育水稻在減數分裂時期小孢子母細胞的細胞質呈現出收縮退化等跡象。

鈣是植物生長發育過程中不可缺少的元素之一，ca²⁺作為植物的第二信使廣泛參與并調節著植物體內的生理生化反應，鈣信使系統起作用的最初事態是細胞內Ca²⁺濃度在時間和空間上的變化，通過與鈣調蛋白的結合直接激活了蛋白激酶的活性或間接地調控其它酶類蛋白的活性，將外部刺激轉換成對植物細胞代謝活動的調控，雄性不育是雜種優勢利用的基礎，對雄性不育機理的探索非常活躍，Ca²⁺在雄性不育中的作用是研究熱點之一，Tian等在光敏核不育水稻花藥中首次發現了Ca²⁺與花粉育性轉換有關：可育花藥發育晚期小孢子細胞質中的Ca²⁺很少；而不育花藥的小孢子細胞質中卻積累豐富的Ca²⁺，從而提出小孢子細胞質內Ca²⁺的異常積累可能是導致花粉敗育的一個重要因素，隨后孟祥紅等在光敏胞質不育小麥也發現類似現象，最近，謝潮添等在白菜細胞核雄性不育花藥的鈣分布研究中發現，花粉內過低的Ca²⁺導致花粉敗育：可育小孢子從四分體釋放出后，細胞質中的鈣顆粒明顯增加，為大液泡的形成做準備；而在不育花藥中，小孢子細胞質中的鈣顆粒很少，阻礙小孢子形成大液泡，從而使細胞體積不能與花粉外壁同步膨大，產生了明顯的質壁分離現象，最終通過細胞質收縮方式敗育，本文對溫敏雄性核不育水稻花藥發育過程中鈣分布的研究結果表明：減數分裂時期，可育花藥中的小孢子母細胞內Ca²⁺很少，而不育花藥中的小孢子母細胞內Ca²⁺相對豐富，以細胞質收縮的方式敗育；單核早期，可育花藥中的花粉細胞內的鈣離子仍然很少，而不育花藥中的花粉內分布豐富的Ca²⁺，隨著發育的進行，花粉細胞質收縮退化，形成空癟的花粉粒，同時，可育花藥藥室內的Ca²⁺很少，而不育花藥藥室內積累異常豐富的Ca²⁺，因此，水稻溫敏雄性核不育系在溫度敏感的小孢子母細胞形成至單核花粉期，Ca²⁺在不育花藥的小孢子母細胞和單核花粉的細胞質內大量積累，產生Ca²⁺中毒，導致細胞內生理生化代謝紊亂，同時藥室內異常豐富的Ca²⁺可能使花粉滲透調節失常，最終導致小孢子母細胞或花粉的細胞質收縮敗育。

藥隔維管束組織輸送水分和養料供給花粉發育需要，藥隔組織的異常會引起輸導功能障礙，影響物質供應，導致雄性不育，吳鈿等指出溫度敏感的雄性核不育基因除了導致花藥壁各層的發育異常，影響花粉粒的形成和成熟過程外，也影響藥隔維管束導管、篩管和維管束鞘的發育，在本研究結果也證實溫敏雄性核不育水稻不育系花藥的藥隔維管束鞘細胞體積小且形狀不規則，藥隔組織中分布許多的Ca²⁺顆粒；在可育系花藥中，藥隔維管束細胞的體積大且形狀規則，藥隔組織中的Ca²⁺顆粒較少，與利容千等對水稻紅蓮一粵泰不育系與保持系花藥中Ca分布的研究結果相似，因此，藥隔組織中細胞的異常結構和鈣的異常分布均可能影響其正常功能的發揮，從而影響花藥壁細胞功能和花粉的發育，其原因有待探討。