高相對分子質量裂褶多糖的制備與結構鑒定出境

葉 誠 周蓬蓬 余龍江 何 峰 魯明波

摘 要：以裂褶茵(Schizophyllum commune)發酵生產的培養物為研究對象，經過活性炭脫色、Sevag法脫雜蛋白、乙醇沉淀得粗多糖，再經Sephadex G-200柱層析分離純化得裂褶多糖純品，通過Sephadex G-200凝膠層析法測得其平均分子質量為436kDa；由氣相色譜、紅外光譜、高碘酸氧化、Smith降解、¹³C核磁共振等方法表征其化學結構，推測其結構為具有(1→6)分支的β-(1-3)-D-葡聚糖：其組成重復單元應該合有3個主鏈糖基和一個單糖分支，主鏈的取代發生在C-1和C-3之間，即為1→3糖苷鍵；分支發生在C-1和C-6之間，即為1→6糖苷鍵，其中分支點在主鏈糖基的C-6上。

關鍵詞：裂褶菌；胞外多糖；分離化；結構鑒定

中圖分類號：Q93

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)02-0100-05

多糖是一類大分子化合物，一般由一百個以上甚至幾千個單糖通過糖苷鍵連接而成，近年來，隨著分子生物學和細胞生物學的發展，人們得到了有關糖的結構和功能越來越多的信息，逐步認識到糖是除核酸和蛋白質之外另一重要的生命物質，具有多種生物學功能，多糖尤其是相對分子質量大于50kDa的高相對分子質量多糖，在增強免疫、抗腫瘤等方面具有顯著的生物活性，本文以裂褶菌(Schizophyllum commune)發酵培養物為研究對象，從中提取粗裂褶多糖，并由該胞外多糖(Schizophyllan，簡稱SPG)進一步分離純化得到一種高相對分子質量裂褶多糖SPG₁₃，分析了純多糖的理化性質，為進一步開發應用奠定了重要基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 菌種

本研究菌種購于中科院微生物研究所菌種保藏中心，經鑒定，確定其為裂褶菌(Schizophylluncommune)。

1.1.2主要試劑與儀器

Sephadex G-200，藍色葡聚糖和標準相對分子質量多糖(Dextram T-10，Dextram T-40，DextramT-70，Dextram T-500)(Pharmacia公司)，其他試劑均為進口或國產分析純，UV-2100型可見紫外光分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；GC一9790氣相色譜儀；VERTEX-70傅立葉變換顯微紅外／拉曼光譜儀，德國Bruker公司；AV400雙通道全數字化傅立葉超導核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司。

1.1.3樣品制備

以裂褶菌發酵培養物為材料，收集發酵液，8000r/min，離心20min，棄沉淀，上清液中加入粉末狀活性炭，水浴，加熱攪拌15min，抽濾，濾液置于旋轉蒸發儀中，濃縮體積后得粘稠、透明狀液體，脫色后的發酵液用Sevag法除蛋白，重復3次后，向已脫蛋白的發酵液中加入2.5倍體積的95％乙醇，出現大量白色絮狀沉淀；搖勻，4℃靜置過夜，6000r/min離心20min，收集沉淀，冷凍干燥，得粗多糖。

1.2方法

1.2.1 SPG多糖的理化性質的測定方法

觀察SPG粗多糖的顏色、狀態和溶解情況，并進行化學性質實驗：苯酚—硫酸反應、蒽酮，硫酸反應，

1.2.2柱層析純化

脫色，脫雜蛋白后的SPG粗多糖進行柱層析分離、純化，分別選取Sephadex G-100、SephadexG-150、Sephadex G-200為填料裝填于1.6cm×100cm層析柱中，比較其以0.5％和0.9％氯化鈉溶液洗脫時的分離效果，流速控制在大約0.3mL/min，每管收集3mL，分部收集，每管取少量收集液，苯酚一硫酸法檢測，490nm測其OD值，按照管號對光密度繪制洗脫曲線，對比洗脫效果，選取最適洗脫條件；選取最佳填料與條件進行多糖的純化，將最大峰處的洗脫液合并，減壓濃縮，冷凍干燥，得到多糖純品。

1.2.3 紫外及紅外光譜分析

試樣配成0.1％水溶液，對190～400nm區間進行紫外掃描，SPG₁粉末經KBr壓片，在4000am^-113～500CB^-1區間進行紅外掃描。

1.2.4 Sephadex G-200凝膠過濾測定相對分子質量

稱取SephadexG-2008.5g，加雙蒸水溶漲72h，裝填于層析柱中(1.6 cm×100cm)，用0.9％氯化鈉水溶液平衡3d，分別稱取已知分子質量的葡聚糖T500、T70、T40、T10和藍色葡聚糖各3mg，用少量蒸餾水溶解后依次上柱，用0.9％氯化鈉水溶液洗脫，每3mL收集一管，苯酚一硫酸法顯色，490nm測其OD值檢測各糖的洗脫體積Ve，用藍色葡聚糖測出外水體積Vo，依Ve/Vo與相對分子質量的對數關系得標準曲線，稱取SPG₁3mg，用少量水溶解，以同樣條件上柱洗脫。

1.2.5 GC檢測單糖組成分析

準確稱取SPG₁20.0 mg于安瓿瓶中，加入1tool/L硫酸3.0 mL，封口，置90℃烘箱水解6～12h，用碳酸鋇緩慢中和至pH=7.0，離心(4000r/min，10min)，上清液濃縮至干；加入鹽酸羥胺90mg，吡啶4mL，在90℃的水浴中加熱反應10min后取出，放至室溫；加4mL乙酸酐再置于90℃水浴中反應20min，得糖腈乙酰酯衍生物，再準確稱取各標準單糖10mg，以同樣的方法制成標準品的糖腈乙酰酯衍生物，進行氣相色譜分析，色譜條件：OV-225毛細管柱，柱溫240℃，載氣為氮氣，流速30mL/min，氫氣流速48mL/min，衰減6～7，樣品與標樣進樣量均為2μL，根據保留時間與標樣對比分析。

1.2.6 高碘酸氧化和Smith降解

SPG₁多糖200mg溶于100mL 0.025 mol/LNa10⁴中于暗處，12℃，間隔時間取樣，稀釋，在223nm測定高碘酸消耗量，將溶液中加入乙二醇放置10min，以終止反應，還原剩余的高碘酸，用溴甲酚紫為指示劑，用0.01mol/L，NaOH滴定甲酸釋放量。

高碘酸氧化物經Smith降解得多糖醇，再經2mol/L硫酸于90℃水解8h，碳酸鋇中和，離心，上清液減壓濃縮，采用紙層析檢查降解產物，展層劑為乙酸乙酯：吡啶：水(10：4：3)，顯色劑為聯苯胺，鄰苯二甲酸，以葡萄糖、甘油、赤蘚醇為對照。

1.2.7 ¹³C核磁共振分析

少量SPG₁溶于重蒸水，經AV400雙通道全數字化傅立葉超導核磁共振譜儀反應17h，檢測溫度298.7K，共振頻率100.6MHz，累加次數32768次。

2 結果與分析

2，1理化性質

物理性質：SPG多糖為純白色，冷凍干燥后呈蓬松海綿狀，無臭無味，溶于水，易溶于熱水，不溶于高濃度的乙醇、乙醚、丙酮、異丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑。

化學性質：pH中性，蒽酮試劑反應呈藍綠色，苯酚一硫酸試劑反應呈紅色。

2，2分離及純化

通過對比分離效果，確定當選取SephdexG－200為填料，氯化鈉溶液濃度為0.9％時為SPG多糖的最佳洗脫條件，從圖1可看出裂褶多糖粗多糖洗脫后得到兩個裂褶多糖組分，SPG₁、SPG₂，根據葡聚糖凝膠的洗脫規律，SPG₁應為其中相對分子質量較大的組分，取SPG₁進行研究，對SPG₁進行了純化，由圖2可知只有一個洗脫曲線，因此SPG₁為均一成分。

2，3純度分析及紅外光譜分析

SPG₁經190～400nm區間紫外掃描，僅在196nm處有多糖特征吸收峰(圖3)，無核酸(260nm)、蛋白質(280nm)等雜質峰，

SPG₁紅外光譜分析結果(圖4)表現出一般多糖類物質的特征吸收峰：3545em^-1的寬峰是-OH鍵的伸縮振動峰，1623em^-1左右有C-O非對稱伸縮振動峰，1138em^-1左右有O-H變角振動峰，669cm^-1處的吸收峰為吡喃型β糖苷鍵的特征峰，由以上結果可以推斷SPG₁為一種β型吡喃多糖。

2，4相對分子質量的測定

藍葡聚糖與各標準葡聚糖的洗脫曲線見于圖5，5個峰從左至右分別是藍色葡聚糖、T500、170、T40和T10的洗脫曲線；同時，根據各洗脫體積繪制的標準曲線見于圖6，根據SPG₁的洗脫體積與標準曲線之間的關系，查得SPG₁₃的相對分子質量約為436kDa。

2.5單糖組分分析

對標準多糖進行了氣相色譜(圖7)測定，圖中出現了5個峰，從左至右分別是鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，SPG。完全酸水解產物，經糖腈乙酰酯衍生化以后，GC分析結果(圖8)僅出現一個組分峰，通過與標準單糖保留時間(圖7)對比，確定該組分為葡萄糖，說明sPG₁是由葡萄糖單一組分構成。

2，6高碘酸氧化和Smith降解

SPG₁多糖經高碘酸氧化完全后，測得每摩爾單糖消耗高碘酸0.56mol，同時釋放甲酸0.26mo1，高碘酸的消耗量為甲酸生成量的2倍；Smith降解產物中只含有甘油和葡萄糖，說明有(1→6)糖苷鍵存在。

SPG₁的核磁共振波譜如圖9所示，糖環上不同位置的碳原子發生取代后，不管是二糖、寡糖及多糖，只要取代基的結構相同，其向低磁場化學位移也基本相似，另一個有用的原則是，糖環上發生取代的碳原子的化學位移有較大的變化，根據以上規律，獲得圖譜后，先考查相應范圍的信號，以確定有沒有取代發生。

根據其各化學位移與已知結構含有β(1-6)連接支鏈的β-(1.3)-D-葡聚糖如Lentinan、lami-naran等比較，并結合圖譜中各峰的相對高度比可知：組成SPG₁的重復單元應該含有3個主鏈糖基和一個單糖分支，主鏈的取代發生在c-1和C-3之間，即為l→3糖苷鍵；分支發生在C-1和C-6之間，即為1→6糖苷鍵，其中分支點在主鏈糖基的C-6上。

3討論

本文采取活性炭脫色、Sevag法脫蛋白初步純化、乙醇沉淀、柱層析分離等方法提取純化SPG₁多糖，取得了良好的效果，獲得了相對分子質量約436kDa的高相對分子質量裂褶多糖，通過GC分析確定SPG₁由葡萄糖單一組分構成；紅外光譜、高碘酸氧化、Smith降解、¹³C-NMR分析基本確定其化學結構為帶有β-(1.6)葡萄糖分支的β-(1-3)-D葡聚糖；G-200凝膠層析法測定其相對分子質量為436 kDa.SPG₁的結構與多種具有增強免疫、抗腫瘤等生物活性的微生物β(1-3)-D葡聚糖相吻合，由此可預測，SPG₁在醫藥領域具有廣闊的應用前景。