Ｐｂ²⁺、Ｃｄ²⁺對３種水生動物致毒效應影響的比較研究

吳本富 胡好遠 郝家勝

摘要：在特定時間(12、24、48、72h)內，研究了Pb²⁺和Cd²⁺對草履蟲(Paramecium caudatum)、三角渦蟲(Dugesiajaponica)和中華圓田螺(Cipangopaludia viviparrus)3種水生動物的單一和聯合毒性效應，結果表明：在同等條件下，Cd²⁺對三者的致毒效應都明顯強于P²⁺；3種動物中，草履蟲最敏感，而圓田螺耐受能力最強；隨單一毒物濃度的增大以及暴露時間的延長，兩者的致毒效應都顯著增大，表現出明顯的濃度一效應和時間一效應關系；二者復合作用時，對3種動物的致毒效應主要表現為與二組分的濃度比例有關，復合致毒效應也表現出了明顯的濃度一效應關系，并且濃度和暴露時間的交互作用對3種水生動物毒性都有顯著的影響。

關鍵詞：Pb²⁺；Cd²⁺；草履蟲；渦蟲；圓田螺

中圖分類號：S912

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)02-01－83-06

由于根據單一污染物質制定的有關環境容量和環境評價標準無法真實地反映實際狀況，且越來越多的污染物進入環境并共存，因此復合污染的研究已引起國內外科技工作者的高度重視，并已成為當前環境科學和生態毒理學領域的研究熱點，近些年，關于重金屬對環境復合污染方面的研究雖然取得了較大的進展，但從目前的資料來看，這些研究多局限在土壤受重金屬污染后對動、植物的形態、生理生化、細胞和分子水平的研究上，而對不同毒物的聯合作用以及水生低等動物的研究則較為局限，只有少數集中在魚類和甲殼類動物等經濟動物的急、慢性毒性試驗研究上，而對常見的水生低等動物的研究則相對較少。

草履蟲(P·caudatum)、日本三角渦蟲(D·japonica)和中華圓田螺(C·viviparrus)都是常見的微型或小型淡水低等動物，在水生生態系統中占有重要地位，本研究運用重金屬離子pb²⁺、Cd²⁺的單一和復合處理，在不同處理時間和組合濃度條件下探究了它們對3種水生動物的毒性影響，以期獲得可用于水體重金屬污染監測的幾種模式動物的耐受指標，從而為水環境中重金屬的生物毒性預測以及當前水體環境污染的治理提供一些基礎資料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物采集與培養

草履蟲于稻草培養基(10g稻草+1000mLEP緩沖液)中，在生化培養箱中20℃恒溫、自然光照條件下進行“克隆”培養以備實驗；渦蟲和圓田螺(圓田螺清洗外表)分別以雞蛋黃和淡水藻，保持死亡率<1％。

1.1.2 實驗毒物

分別用蒸餾水配制pb²⁺和Cd²⁺濃度為100g/L(以純pb²⁺和Cd²⁺計算)的母液100mL，于冰箱4℃保存，用前稀釋為所需的濃度。

1.2方法

1.2.1毒性買驗

分別對草履蟲和渦蟲以及圓田螺進行48h和72h的pb²⁺、Cd²⁺單一染毒預測試驗，分別得出3種動物在48h和72h的全部存活濃度和全部死亡濃度，在此范圍內用等對數間距法，分別對該2種金屬離子設置7個濃度組，另加一個空白對照組，每組設置3個重復進行試驗(實驗設計見表1)，聯合毒性實驗分別是在其單一實驗基礎上，以單一實驗的pb²⁺各濃度分別同3個不同濃度的Cd²⁺復合，Cd²⁺濃度具體為，草履蟲：0.005、0.01和0.05mg/L；渦蟲：0.25、1.25和2.5mg/L；圓田螺：5、25和50mg/L實驗過程分別如下，草履蟲毒性實驗：分別在普通的2mL Ependorf管內加對應毒物濃度梯度的稻草培養基2mL，并向每只管內隨機挑取10只備用的草履蟲于Epen-doff管內，置生化培養箱于20℃恒溫、自然光照進行試驗，每天定時觀察，以不游動的判斷為死亡，并分別記錄各組12、24h和48h的死亡數并計算其死亡百分率(達到或超過10個個體按死亡率為0計算)；渦蟲毒性實驗：分別在50mL的燒杯內加入對應濃度梯度的試劑50mL，并隨機挑選10只備用渦蟲于燒杯內，置生化培養箱于20℃恒溫、自然光照下進行試驗，實驗過程無進食，每天定時觀察，以探針刺激身體沒有反應視為死亡，分別記錄各組24、48h和72h的死亡數并推算其死亡百分率；圓田螺實驗：分別在100mL的燒杯內加入對應試劑濃度梯度的試劑100mL，并隨機挑取備用的圓田螺10只于燒杯內，以探針刺激厴部沒有反應判斷為死亡，實驗條件和觀察記錄方法同上。

1.2.2數據處理與分析

根據單一毒性實驗死亡百分率，采用Probit法，在EXCEL中得出機率單位與濃度對數的線形回歸方程，分別計算出pb²⁺、Cd²⁺對3種動物在對應時間的LCso值以及安全質量濃度(safetyconcentration，SC)(SC=0.3x48h LC₅₀/(24h LC₅₀/48h LC₅₀)²)，根據sc值判斷各動物對金屬離子的敏感性，根據聯合毒性死亡率，用SPSS 11.5軟件對暴露時間和毒物組分比例對死亡率的影響進行多重比較分析。

2結果與分析

2.1單一毒性實驗

2.1.1 3種動物中毒癥狀

3種動物的中毒癥狀與毒物的濃度和種類都有關，草履蟲在較低濃度時(Pb²⁺≤1.35mg/L或Cd²⁺≤0.24mg/L)與對照組基本相似，整個身體翻轉向前游動；而在高濃度時(Ph²⁺≥10.00 mg/L或Cd²⁺≥1.00mg/L)游動急促且方向多變，并隨暴露時間的延長，個體游動減慢并死亡漂浮，其中Cd²⁺組殘體腐爛較快，渦蟲在較低濃度(Pb²⁺≤135mK/L或Cd²⁺≤18mg/L)時與對照組活動基本相似，身體伸展且緩慢爬行；而在高濃度(pb²⁺≥210mg/L或Cd²⁺≥42mg/L)時，與對照組和低濃度組相比，表現出明顯的爬行加快且身體不停翻轉，死亡個體萎縮卷曲，pb²⁺組軀體灰白完整，而Cd²⁺組則軀體腐爛等，圓田螺在較低濃度(pb²⁺≤280mg/L、Cd²⁺≤21mg/L)時與對照組活動相似，個體厴張開并大多伸出頭部，且隨時間的延長活動情況基本都保持不變；而在高濃度(pb²⁺≥370mg/L、Cd²⁺≥49mg/L)時，厴緊閉并釋放大量的白色分泌物，其中，pb²⁺組的厴一直緊閉，而Cd²⁺組在死亡前厴張開。

2.1.2數據分析處理結果

單一毒性實驗結果經單因素方差分析表明，pb2和Cd>的濃度對3種水生動物的死亡率都有顯著性影響(P<0.05)，其死亡率都隨毒物濃度的升高而增大，表現出明顯濃度一效應關系(R²>0.5)，但兩毒物濃度大小對該3種動物的毒性影響存在差別：pb²⁺對渦蟲死亡率有極顯著影響(P<0.01)，而Cd²⁺卻對圓田螺的有極顯著影響(P<0.01)，可見，不同的動物對毒物的種類及濃度敏感性有較大的差異，在pb²⁺或Cd²⁺處理情況下，三者的死亡率都隨暴露時間的延長而增大，表現出一定的時間一效應關系(R²>0.5)，但只有pb²⁺暴露時間對渦蟲和圓田螺影響顯著(P<0.05)，其它差異不具有統計學意義(P>0.05)，可見，不同動物對毒物的耐受性也存在很大的差別，由Probit法，分別計算出pb²⁺、Cd²⁺對3種動物在對應時間的LC₅₀值以及安全質量濃度(SC)，結果是無論對pb²⁺或Cd²⁺來說，圓田螺的安全質量濃度都約是草履蟲的300倍，渦蟲介于兩者之間，3種動物對pb²⁺和Cd²⁺敏感性為>草履蟲>渦蟲>圓田螺，對3種水生動物而言Cd²⁺的sc值都約是pb²⁺的十分之一，Cd²⁺毒性明顯強于pb²⁺(見表2)。

2.2復合霉性買驗

3種水生動物的pb2+Cd2+復合毒性結果經多重比較分析(SNK和LSD法)表明：就同一處理濃度組而言，暴露時間對3種水生動物的死亡率都有極顯著影響(P<0.01)，只有草履蟲在12h和24h之間一率隨時間增大不明顯外(P>0.05)，其它都隨暴露時間的增大死亡率極顯著增高，表現出明顯的時間一效應關系；組合毒物濃度比對草履蟲和渦蟲的死亡率都有極顯著影響(P<0.01)，并且和暴露時間的交互作用對死亡率有極明顯的影響(P<0.01)，而對圓田螺影響并不明顯(P>0.05)，具體如下：

草履蟲：暴露時間和復合毒物濃度對其死亡率都有極明顯的影響(P<0.01)，隨暴露時間的延長其死亡率明顯提高，但不同時間其影響大小有所差異，在高濃度(7.5、10.0和13.5mg/L)Pbn組中，24～48h時間段的死亡率極顯著增大；復合毒物的組分濃度比例對之毒性影響相對復雜，對照組(單一Pb²⁺)與同組各聯合組的死亡率相比，經統計表明，pb²⁺與cd²⁺之間的組分濃度比例對死亡率的影響存在明顯交互作用，高濃度(0.05mgL)Cd²⁺與低濃度(1.00mgL)pb²⁺聯合時，其死亡率要明顯高于對照組，表現出兩者的毒性的協同作用；而高濃度(2.4、4.2、…、7.5mg/L)組，pb²⁺與任意濃度的Cd²⁺聯合時其死亡率都顯著小于同組對照組，則表現為毒性的拮抗作用(見表3)。

渦蟲：暴露時間和組合物濃度對其死亡率有極顯著影響(P<0.01)，隨暴露時間的延長其死亡率隨之增大極為明顯，尤其在中濃度(1.25mg/L)Cd²⁺組，其死亡率在24～48h時間段明顯大于48～72h時間段，對照組(單一Ph²⁺)與同組各聯合組的死亡率相比，pb²⁺與Cd²⁺之間的濃度組合對其死亡率存在一定的交互作用：低濃度(0.25mg/L)Cd²⁺與各濃度組pb²⁺聯合時，其死亡率隨pb²⁺濃度的增加而增大，但都小于同組單一pb²⁺，表現出一定的毒性拮抗作用；而中濃度(1.25mg/L)和高濃度(2.5mg/L)cd²⁺與各濃度pb²⁺聯合時，隨pb²⁺濃度增大其死亡率要極顯著大于其對照組，其中高濃度(2.5mg/L)cd²⁺各聯合組死亡率都為100％，表現出明顯的毒性協同作用(圖3)。

圓田螺：多重比較結果表明，毒物的組合物濃度對死亡率的沒有顯著影響(P>0.05)，組合濃度和暴露時間之間無明顯交互作用；對照組(單一pb²⁺組)與同組各聯合組的死亡率的對比統計表明，低濃度(5mg/L)Cd²⁺聯合組的死亡率要明顯小于同組對照組(P<0.01)，尤其當pb²⁺在較高濃度(490、560和650mg/L)時，其死亡率降為零，表現出明顯的拮抗作用，而高濃度Cd²⁺(25.50mg/L)的聯合組與對照組沒有明顯差異(P>0.05)(圖4)。

3討論

有關研究表明，生物體暴露在pb²⁺和Cd²⁺污染環境中，毒物可以通過各種途徑進入生物體內，并和體內特定物質發生一系列的生化反應，致使酶活性誘導或抑制、細胞膜破壞、蛋白質合成受阻等，最后引起一系列病理、生理的繼發反應，表現出整個機體的毒性反應，呈現出一定的劑量一效應關系，本研究顯示，3種水生動物的死亡率都隨單一pb²⁺和Cd²⁺濃度的升高而增大，表現出一定的濃度一效應關系，Devkota等以及孫瑞蓮等的研究表明，毒物的毒性的大小主要取決于受試動物對毒物的排斥性和耐受性，且小同種類個體其排斥性和耐受性都存在差異，這些結論與本研究出現的pb²⁺和Cd²⁺對不同動物結果基本一致，即pb²⁺濃度對渦蟲有極顯著影響，而Cd²⁺濃度對圓田螺有極顯著影響；3種動物對pb²⁺和Cd²⁺的毒性敏感順序為草履蟲>渦蟲>圓田螺；對同種動物來說，Cd²⁺的毒性要明顯大于pb²⁺相一致，另外。對草履蟲、渦蟲和圓田螺的復合毒性研究結果顯示，同樣條件下不同毒物濃度組合會影響毒物的聯合作用類型，從而表現出兩者的毒性相加或協同作用以及拮抗作用，這些結果與修瑞琴等以及Kim的結論存在相似之處，在圓田螺和草履蟲實驗中，草履蟲在高濃度(0.05mg/L)Cd²⁺與低濃度(1.00mg/L)Pb²⁺聯合時，死亡率要明顯高于對照組，表現出毒物毒性的相加作用，而高濃度pb²⁺與任意濃度的Cd²⁺聯合時其死亡率都顯著小于同組對照組，則表現出明顯的毒物之間拮抗作用，圓田螺在一定濃度(490、560和650 mg/L)的pb²⁺與Cd²⁺聯合時，其死亡率降為零，也表現出明顯的拮抗作用，這些可能是Cd²⁺的存在能直接競爭抑制pb²⁺在草履蟲或圓田螺體內的結合或者能加快pb²⁺代謝并排出體外有關，在渦蟲的聯合毒性實驗中，Cd²⁺與任何濃度組的pb²⁺聯合時，其毒性都表現出相加或協同作用，這可能是Cd²⁺與pb²⁺在動物體內的結合部位不同，或者是兩者的存在能促進其在體內的積累，從而導致生物體內的毒物疊加而造成毒性增大，張義賢和蔣玫等研究表明，污染物濃度和暴露時間對受試生物體的毒性影響存在著時間一效應關系，隨暴露時間的延長，其毒性效應相應加大，本文中3種動物的毒性實驗結果與之基本一致，但聯合毒性試驗結果相對復雜，其毒性大小不僅與暴露時間有關，還與組合物的比例有關，草履蟲在高濃度組pb²⁺(7.5、10.0和13.5mg/L)時，其24～48h時間段的死亡率極顯著大于前段時間(0～12h)各組，當渦蟲和圓田螺分別在Cd²⁺濃度為1.25 mg/L和25以上時，與各濃度pb²⁺組聯合，其24～48h時段各組的死亡率都要明顯大于其它各時段，這主要可能是因為生物體暴露在不同濃度污染環境下，毒物可以通過特定途徑由體表進入體內，并體內的某些位點結合從而造成對生物體毒害，這一過程又會由于不同動物對不同毒物濃度以及毒物的聯合作用機制有所差別而造成其毒性大小的差別，或者是不同種類個體其本身就對毒物排斥性和耐受性都存在差異所致，從而出現不同動物對不同的毒物種類和濃度及其聯合作用的不同時間一效應關系。