ＡＢＩ １７００芯片分析系統在基因差異表達研究中的應用

丁大鵬 馬文麗 石 嶸 周玨宇 郭秋野 鄭文嶺

摘要：應用化學發光法標記技術分別對正常和臨床慢性髓細胞性白血病(chronic myelogenous leukemia.CML)病人骨髓單個核細胞的RNA進行標記，然后與ABI的人全基因組表達譜芯片雜交，對于雜交后所得到的熒光信號數據，應用1700芯片分析系統對其進行生物信息學分析，實驗結果表明，ABI1700芯片分析系統可以對基因芯片雜交后得到的差異表達基因進行疾病學分類和生物功能分類分析，同時還發現與CML相關的差異表達基因75個，因此ABI 1700芯片分析系統在芯片研究領域中具有重要的應用價值。

關鍵詞：ABI 1700芯片分析系統；差異表達基因；慢性髓細胞性白血病

中圖分類號：R-331

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)02-0134-05

基因表達譜芯片作為一項高靈敏度、高通量、平行化檢測基因表達的生物技術，目前在分子生物學研究領域得到廣泛應用，通過對芯片所得到的數據進行統計學分析，找出實驗所感興趣的基因表達改變，從而在分子水平上對相關基因的生物學功能進行闡述，但是由于統計學方法的多樣性以及芯片種類本身對數據處理方法的要求存在偏差，在芯片實驗之后，往往需要投入比較多的時間和費用對所得到的差異基因的生物學功能進行比較系統和科學的研究，ABI1700芯片分析系統是商品化的、基于生物芯片實驗室的芯片分析系統，通過完整的芯片實驗流程，可在全基因組水平上對差異表達基因的生物學功能進行綜合分析，本實驗選用ABI1700全基因組表達譜芯片分析系統對正常人和慢性髓細胞性白血病病人的骨髓單個核細胞的基因表達差異進行分析，來探索這一基于生物芯片實驗的芯片分析系統在基因表達差異研究中的應用。

1材料與方法

1.1材料

慢性髓細胞性白血病的骨髓樣品由廣州軍區總醫院血液科提供，同時與之對照的是同年入院患者的正常骨髓樣品，1700芯片分析系統由美國ABI生物公司提供，實驗中所用的芯片和相關試劑均由系統本身所附帶，總RNA提取試劑(Tri-zol)及PCR產物純化試劑盒購自上海博彩生物工程公司；mRNA純化試劑盒購自Pharmacia公司；逆轉錄酶SuperScriptⅡ購自Gibco公司；E.coli聚合酶I、Rnase H、Taq酶及其他常用酶類購自TaKaRa公司。

1.2樣品制備

1.2.1細胞總RNA的提取

分離骨髓樣品，按照Trizol法提取細胞的總RNA，具體操作步驟參照文獻，并采用AgilentBi0Analyzer 2100進行RNA樣品的質量檢定。

1.2.2逆轉錄合成cDNA

兩個標本各取總RNA2μg，加入5μLT7啟動子引物，加無核酸酶水至總的反應體積為11.5μL，65℃水浴10min，冰上放置5min，然后加8.5trL cDNA Master Mix(含5×第一鏈緩沖液4μL，0.1mol/L DTT 2μL，10mmol／LdNTP混合物1μL，逆轉錄酶MMLV1 μL，RNA酶抑制劑0.5μL)，40℃水浴2h后，65℃15min滅沽MMLV-RT，冰上孵育5min。

1.2.3 CRNA合成與標記

合成好的CDNA樣品應用地高辛標記試劑盒按照線性擴增流程，在合成CRNA的同時，進行底物的地高辛標記，生成標記有地高辛的CRNA。

1.2.4熒光標記CRNA的純化

在cRNA標本中加入20 ILL無核酸酶水，350μL RLT緩沖液，混勻后加入250μL無水乙醇，完全混勻，將混勻后的cRNA樣品轉移到RNeasy微型純化柱，并將該純化柱置于2mL收集管中以13000r/min離心30s，棄濾出液和收集管，將純化柱轉移到一個新的收集管中，并向純化柱中加入500μL的RPE緩沖液，以13000r/rain離心30s，棄濾出液，再向柱子中加入500μL的RPE緩沖液，以13000r/min離心60s，棄濾出液，將純化柱轉移到一個新的1.5mL收集管中，在純化柱濾膜中央加入30μL的無RNA酶水，室溫放置60s后，以13000r/min離心30s洗脫純化的cRNA樣品，重復以上洗脫步驟一次，最終濾出的總體積大約為60μL，BeckmanDU530紫外分光光度儀測定樣品的濃度后，-80℃遮光貯存，純化后的CRNA即可用于芯片雜交。

1.3芯片雜交、洗片和掃描

按照ABI公司化學發光檢測試劑盒的操作流程進行樣品與芯片的雜交，然后選擇用ABll700系統自帶軟件來進行芯片掃描和數據分析。

2結果

1)RNA質量控制結果，使用Agilent2100生物分析儀鑒定兩份樣品的RNA質量，1為對照樣品，2為CML病例樣品，如圖1所示，RNA樣品均沒有明顯降解，符合芯片測定要求。

2)芯片雜交結果，芯片周邊以及內部的陽性對照點信號清晰，雜交信號強度高，亮度好，并且雜交結果中的背景信號比較小，信噪比高，如圖2、3所示。

3)通過兩樣本T檢驗來篩選差異基因，P值小于0.01有統計學差異，并應用假陰性率(FalseDiscovery Ratio，FDR)的P值來對T檢驗結果進行調整，共篩選出差異表達基因6706個，應用ABI 1700芯片分析系統對差異表達基因進行相關疾病和生物學功能分類與分析，首先應用Pan—ther生物學軟件對得到的差異基因進行生物學功能分析，即將差異表達基因所在的生物學功能進行分類，見表1；然后對其中與CML相關的差異表達基因用Jubilant軟件進行病理疾病篩選，如表2所示，

4)對篩選得到的差異表達基因，應用1700芯片分析系統分析不同生物代謝通路中的差異基因，將基因歸到具體代謝通路中進行研究，如表3所示。

3討論

表達譜基因芯片的出現為檢測整個基因組的表達信息提供了一個極為有利的工具，通過對成千上萬基因表達進行平行分析，獲得了大量的數據，如何進一步分析其潛在的生物學信息，是當前一項具有重要意義的研究工作，目前結合生物信息學的基因芯片數據分析已經成功應用到許多領域，比如腫瘤基因的突變研究和藥物靶點的篩選等，但是從數據分析操作的過程來看，在處理和分析數據的具體步驟中仍然存在許多不精確的地方，基于芯片實驗的1700生物分析系統，能夠更科學、更快速地對芯片所得到的基因數據進行系統的分析和多角度的研究，1700芯片分析系統應用基因表達譜芯片在檢測人或者小鼠全基因組表達豐度的同時，還可以對正常和疾病的組織或者細胞中的差異表達基因進行相關的驗證實驗，

與一般的芯片研究和數據分析相比，1700芯片分析系統具有更高的準確性和重復性，系統采用地高辛對樣品進行標記，然后應用化學發光原理對雜交信號亮度進行檢測，由于化學發光法檢測的高靈敏度，起始總RNA量最少只用500ng就可以進行標記反應，樣品mRNA在進行線性擴增反應的同時，合成標記有地高辛的cRNA，系統應用Agilent2100生物分析儀對提取和標記好的RNA質量進行檢定，保證用于芯片雜交樣品的穩定性和完整性，1700芯片分析系統中芯片點陣的每一個探針都對應于Celera數據庫中的一個基因序列，序列本身已經在NCBI的基因組注釋項目公布的參考序列(REFSEQs)中予以確證，從而使得芯片雜交反應后得到數據的可信度更高，本實驗以正常人和CML患者的骨髓單個核細胞的RNA樣品進行分析比較，從清晰的毛細管電泳圖上可以看出，RNA的質量基本符合基因芯片測定的要求，從而在此基礎上進一步對基因的表達差異進行研究。

對于芯片得到的大量豐富的數據，1700芯片分析系統立足于Celera數據庫對差異表達基因進行相對應的數據分析和生物信息學處理，結合附帶的生物學軟件對芯片數據進行科學的統計分析，從本實驗結果來看，首先應用Panther生物學分類軟件，將6706個差異表達基因按照已經研究的生物學功能進行分類，從而對差異表達基因的種類有一個比較全面的了解，針對每一種生物學功能，還可以結合每個差異基因具體表達量的多少，來對其進行進一步的研究，而本實驗的處理樣品是采自CML患者的骨髓單個核細胞，因此需要探討差異表達基因中哪些是與CML疾病發生發展過程有關的，從1700芯片分析系統附帶的Jubilant病理／疾病分類軟件分析結果來看，共發現有75個基因與CML相關，并且相關可信度具有統計學意義，除此之外，對差異表達基因進行了更深入地分析，來研究其在代謝通路上的作用和相互關系，系統根據目前基因組學的研究，提供不同的代謝通路并將具體的差異表達基因在其中的分布做了統計圖表，以方便根據實驗的需要來進行多層面的分析，同時1700芯片分析系統針對每個基因還配對相應的TaqMan探針來進行后面的驗證實驗。

1700芯片分析系統提供了從芯片到芯片信號的采集和分析，以及表達量驗證的完整性工作，從而使得芯片實驗結果的可信度大大提高，而且對于得到的大量數據，系統本身具有強大的數據庫和分析軟件為基礎，不僅可以對差異表達基因進行生物學分類，還可以針對其不同的代謝通路上的具體作用機制進行深入分析研究，為芯片數據分析的合理化提供了新的思路，同時，由于實驗本身是在一個完整的系統中進行并完成的，在一定程度上也減少了芯片實驗的費用，因此有助于基因表達譜芯片技術在基因功能學研究領域得到進一步的廣泛應用。