蜂毒溶血肽類似物定量構效關系計算分析

摘 要：采用HyperChem7.0結構分析軟件，對蜂毒溶血肽類似物的分子體積等結構參數進行了計算分析，分別利用多元線性回歸、BP－神經網絡計算法進行統計分析，獲得兩個相關性好的QSAR(quantitative structure-function relationship)模型，結果顯示，蜂毒肽溶血活性與生成熱、鍵合能、表面積、分子體積、極化能、醇水分配系數、水合能相關，為降低溶血作用，指出在設計蜂毒肽結構時應盡量避免螺旋狀結構，少用疏水性氨基酸。

關鍵詞：蜂毒溶血肽；構效關系；線性回歸；BP－神經網絡

中圖分類號：Q786

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)02-0038-06

蜂毒溶血肽又稱蜂毒素(melittin)，是歐洲蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒的主要成分之一，它對20多種革蘭氏陰性和陽性細菌有極強的抑殺作用，相對于醫藥上使用的傳統抗生素來說，由于其特殊的作用機理而不易使細菌產生耐藥性，然而，生物體存在的天然多肽其結構與功能之間的關系并非最適合，一般認為，蜂毒肽的溶血機理是其在紅細胞質膜上穿孔而形成離子孔道，造成膜結構破壞，引起胞內物質大量滲出，導致溶血，本文以蜂毒肽類似物為目標分子，運用半經驗計算法對其溶血活性的定量構效關系分析計算，再利用統計方法進行分子建模，找出影響活性的因素，為進一步預測和設計低溶血活性的蜂毒肽分子，避免表達或合成高副作用的蜂毒肽產物提供量化的理論依據。

1 方法

采用各種理論計算方法和分子圖形模擬技術，以計算機為工具，根據累積的大量有關功能分子結構和活性的資料，設計具備某種目標功能的新分子，由于任何分子的生物活性都與它的化學結構密切相關，對目標分子進行結構修飾或改造，有可能使其功能增強、減弱、失活或發生其他改變，定量構效關系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)采用數學模型描述分子的生物學活性與結構之間的定量依賴關系，架設分子的化學結構與生物學功能之間的橋梁，在應用上，QSAR能從一系列已知活性的化合物中找出其結構與活性之間的定量關系，進而預測新化合物活性，并指導新功能分子設計，借助多元統計分析方法能夠將分子結構描述子和性質聯系起來，同時近年來也發展了一些非統計學的方法，如人工神經網絡，遺傳算法等，本文采用逐步回歸與BP神經網絡方法分別對蜂毒肽類似物溶血活性進行建模。

選擇分別刪除了不同單一氨基酸的24個蜂毒肽類似物進行計算，溶血活性參考文獻[3]，運用Hy-perChem7.0軟件進行分子的量子化學與分子力學計算，用DNAstar分析多肽等電點，共計算了19個參數，采用DPS7.0統計軟件，用上述兩種統計方法建模，未特殊指明的參數均為系統默認值。

1.1 多元線性回歸

采用多元線性回歸(multiple linear regres－sion，MLR)，分析多個自變量與因變量之間的線性關系，設自變量為x₁，x₂，…，X_M，因變量為Y，將一個m元線性回歸的數學模型表示為：

Y=b_o+b₁X₁+b₂X₂+…+b_mX_m

式中b_o為常數項，自變量x_j前的系數b_j，稱因變量Y，對自變量x_j的偏回歸系數，復相關系數尺為：

R=(SSR／SST)^1/2

式中SSR為回歸平方和，SST為總的偏差平方和。

1.2 BP人工神經網絡

利用人工神經網絡(artificial neural network，ANN)模擬人腦功能的信息處理系統，借鑒人腦神經系統處理信息的過程，并以數學網絡連接的拓撲結構作為理論基礎，BP(back-propagation)算法由正向傳播和反向傳播兩個過程組成，正向傳播的輸入信息由輸入層經隱含層傳向輸出層，如果在輸出層不能得到期望的輸出，則轉入反向傳播，將誤差信息沿原來的連接通路返回，修改各層節點問的連接權重值，如此往復調整網絡參數，使之誤差函數達到極小為止，在處理實際問題時，利用一組已知的樣本構成訓練集(輸入一輸出模式)令其處理，根據一定處理規則調整連接權重，處理結束時，得到1組固定的連接權重值，并將其表達在網絡的權重中，利用這組權重，根據未知樣本的輸入特性參數，可迅速輸出預測結果。

2 計算與回歸分析

2.1 參數計算

蜂毒溶血肽分子在HyperChem7.0中構建，采用MM+分子力場進行幾何優化，用AM1力場進行半經驗計算，自洽場(SCF)收斂條件為50個迭代，能量差小于0.01，采用Fletcher-Reeves共軛梯度法收斂，RMS<0.1kcal/mol.計算了分子設計中常見的17個參數：分子總能量(Total En-erage)、生成熱(E_f)、分子鍵合能(E_binding)、分子核能(E_nuclear)、分子靜電能(E_e)、分子最高占據軌道能(E_HOMO)、偶極距(Dipole)、分子最低空軌道能(E_LUMO)、溶劑可及面積(Surface Area(Grid))，分子體積(Molectilar Volume)、分子范德華面積[Surface Area(Approa)]、水合能(Hydration Energy)、LogP、極化能(Polarizobility)、折光率(Refractivity)，分子質量(Mass)，EHOMO-ELUMO。

從24個蜂毒肽類似物中抽出17個作為訓練集，另外7個作為預測集，以上述17個參數為自變量，HD50的對數Log(C)為因變量，采用DPS7.5統計軟件對所取參數與分子活性的數據進行逐步(stepwise regression)多元線性回歸和BP.神經網絡分析，得到了蜂毒肽類似物的定量構效關系方程，將經上述過程優化過的蜂毒肽及天然蜂毒肽分子用HyperChem7.0所模擬的分子結構如圖1、2所示，優化前蜂毒肽分子近似一種結構緊密的螺旋，分子處于較高能量狀態，優化后分子結構相對松馳，分子處于較低能量狀態。

2.2 逐步多元線性回歸

從所獲得蜂毒肽結構類似物中隨機抽出17個樣本，應用DPS7.5統計軟件以溶血活性的對數值標準化后為因變量，17個QSAR參數為自變量進行逐步多元線性回歸，選出9個有顯著線性關系的變量，得到回歸方程，9個結構描述變量與溶血活性數據logHDso見表1。

相關系數R=0.888 665，決定系數RR=0.799 069，

Y=-13.83171+1.079E-04X₁-5.714E-07X₂-1.072E-04X₃+2.268-04X₄+4.048E-04X₅-1.299E-03X₆-7.916E-03X₇-6.144E-01X₈-2.179E-01X₉

其中y表示最小溶血濃度并取其負對數，X₁X₂，…，₉分別表示Total Enerage，E_binding，E_f，Surface area，Molecular Voltime，Hydration Energy，LooP，Polarizability。

2.3 BP-神經網絡分析

根據DSP7.5統計軟件中的BP神經網絡所提供的變換參數建模，建立含一個隱含層的神經網絡，輸入層為蜂毒肽類似物的9個結構參數，輸出層為實驗所得HD₅₀的對數值，并將輸入和輸出歸一化到(-1.1)之間，挑選17個樣本為訓練集，建立QSAR模型，神經網絡的訓練終止情況、學習速率、隱含層數和節點數等的選擇對網絡的學習和預測都有較大影響，作者采用試算法，經多次訓練調整，確定蜂毒肽類似物的QSAR模型為含一個隱含層，節點數為9，訓練次數1000，目標誤差0.01，學習速率0.1，學習增長率1.05，激活函數為Logistic函數的一個17.10-1的3層網絡拓撲結構。

2.4模擬統計結果

在24種蜂毒肽類似物中隨機挑選17種。利用逐步回歸與神經網絡建立了QSAR模型，擬合結果見表2.以剩余7種類似物為驗證集，將變量輸入QSAR模型中進行驗證，預測結果見表3.

3 討論

由表2、3可見，用逐步線性回歸與神經網絡建立的QSAR模型得到蜂毒肽類似物溶血參數值HD₅₀，其擬合值及驗證值均較理想，圖3，圖4分別是用兩種方法建模所得預測值和觀測值的過原點回歸曲線，其斜率均接近于1，用未參與建模的6個蜂毒肽類似物進行雙側顯著性相關檢驗，發現4種方法均能在一定程度上使觀測值與預測值在0.01水平上高度相關，表明所建模型正確。

比較表2、3中所列相對誤差及圖3、4的回歸曲線可見，用BP-ANN建立的QSAR非線性模型優于多元線性回歸線性模型，說明蜂毒肽類似物由于其相對分子質量大，不同于小分子化合物，且其作用機理也與小分子藥物不同，從而使其分子結構與活性之間呈現出某種非線性關系，但BP-ANN近似黑箱操作形式，通過已有數據進行訓練，并把記憶的信息存儲到連接神經元之間的連接權值上，即將蜂毒肽的溶血活性數據與結構物理參數之間關系的信息存儲在神經元連接的權值和閾值上，而建模者卻無法從權值和閾值中讀取與蜂毒肽活性有關的相關信息，也無法分析哪些因子如何影響多肽活性，所以神經網絡也有其不足之處，相對而言，多元線性回歸屬于開放型統計方法，它可以得出蜂毒肽的各種結構參數的回歸系數，使我們知道哪些結構參數對其溶血活性起促進或抑制作用。

由線性回歸得到的QSAR方程顯示，蜂毒肽類似物表面積及體積對其溶血活性有重要影響，而表面積與活性呈負相關，與體積呈正相關，表明當分子的體積大而面積小時活性高，因此，只有在分子結構為中空管狀結構時，才能滿足這一要求，本文的計算結果表明，其活性狀態的結構應主要為α－螺旋，通過對蜂毒肽的24個氨基酸進行逐個刪除，測定觀察其抗菌及溶血活性變化發現：除Pro－14外，刪除組成兩個α－螺旋的任一氨基酸(1－9，13－20)都明顯地降低溶血活性，而刪除組成“鉸鏈”及C－端氨基酸對溶血活性影響不大，此外，N－端α－螺旋長度較短時，蜂毒肽的溶血活性也會降低，所以，兼性螺旋對溶血活性是必要的，而對抗菌作用并非如此，對蜂毒肽的非對映異構體、順式和反式對映體的研究證實，非對映異構體蜂毒肽螺旋性很低，不具溶血性，但有抗菌作用，這些前人研究結果都與本模型得到的結論相符。

本文所建QSAR模型顯示，醇水分配系數與溶血活性呈正相關，有研究表明，醇能誘導α－螺旋的形成，因為醇能夠降低溶劑極性，在低極性環境中，醇的疏水基團與蜂毒肽上的疏水基團相互作用，屏蔽了蜂毒肽與水分子接觸，使其與水形成分子間氫鍵的幾率下降，增加了蜂毒肽分子內形成氫鍵的幾率，醇分子在水溶液中一般傾向于形成微團結構，以減少與水的接觸面，這種微團結構有可能增加醇分子疏水部位與蜂毒肽的接觸面，在醇溶液中的蜂毒肽傾向于形成四聚體，對一些特殊的鹵代醇(如HFIP)該作用尤為明顯，提高醇水分配系數有利于增加蜂毒肽類似物的活性，從另一方面也說明蜂毒肽在細胞膜上易形成α－螺旋，并以四聚體形式存在，使膜穿孔導致溶血，刪去任一疏水性氨基酸對溶血活性都有很大影響，當刪去69、1520及13位氨基酸后，使溶血活性下降75％－90％，但刪除親水氨基酸Lys-21和23，則還保留94％和99％的溶血活性，模型還顯示，蜂毒肽類似物的分子極性在溶血過程中起重要作用，分子的極化能與活性呈一定的負相關，即分子極性增強時有利于溶血活性下降，因此蜂毒肽C－端的正電荷區有利于與膜結合。

在模型中發現，另外兩個能量參數，即分子總能量與水合能也涉及到分子體系的穩定性，能量越高的分子越不穩定，其活性相應下降，在QSAR模型中溶血活性與總體能量成負相關很好地說明了這一問題，分子水合能即水合焓，是物質溶于水后釋放的能量，其值越大，溶解度就越大，模型顯示它與溶血活性呈正相關，表明蜂毒肽的溶解度增大時，其水溶液中的濃度上升，形成四聚體機會越多，圓二色譜研究已證實，蜂毒肽的單體沒有二級結構，4個單體聚集形成四聚體，每個單體疏水面向里，圍成一個中心疏水區域，親水面向外，單體之間相互接觸的部位幾乎全部是疏水區域，我們推測，當蜂毒溶血肽四聚體在細胞膜上的疏水作用力和各氨基酸基團間的相互吸引與電荷排斥力達到平衡時，其分子構象是有利于溶解破壞膜結構的形式。

綜上所述，本文建立的蜂毒肽QSAR模型能夠用于預測蜂毒肽類似物的溶血活性，為降低該分子溶血活性，可從以下幾方面進行分子設計，1)結構上應避開中空的管狀螺旋結構；2)性質上應盡量少用疏水性氨基酸；3)由于分子極性對溶血活性影響很小，但對抑菌活性又必不可少，故可適當增加帶正電荷氨基酸比例，利用蜂毒肽類似物生物活性所建立的QSAR模型，可以大大減少篩選高抑菌低溶血蜂毒肽的繁瑣程度，降低研究成本，不失為一種尋找和篩選優良活性肽的有效方法。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。