線蛺蝶亞科蝶類部分類群線粒體ＣＯＩ基因的分子系統發生分析

摘 要：以線粒體細胞色素氧化酶I(COI)基因作分子標記，對線蛺蝶亞科蝴蝶進行序列測定，序列分析的結果表明，經比對和處理后的序列總長度是645 bp，其中有199個變異位點，147個簡約信息位點；所編碼的氨基酸序列中有18個變異位點，7個信息位點，A+T平均含量為69.6％，G+c平均含量為30.4％，堿基組成出現AT偏斜，以蛺蝶亞科及秀蛺蝶亞科物種為外類群，用NJ、MP及貝葉斯法重建了該亞科的系統發生樹，探討了它們主要類群間的系統發生關系，分子系統樹顯示，線蛺蝶亞科由以下3大支系：環蛺蝶族+翠蛺蝶族、線蛺蝶族、麗蛺蝶族構成；其中，環蛺蝶族為單系群(NJ樹也支持線蛺蝶族的單系性)；翠蛺蝶族與環蛺蝶族親緣關系較近：麗蛺蝶族可能是該亞科較早分化出的一支。

關鍵詞：蛺蝶科；線蛺蝶亞科；COI，基因；分子系統發生

中圖分類號：Q969.42

文獻標識碼：A

文章編號：1007.7847(2007)01-0064-08

線蛺蝶亞科(Limenitinae)隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)蛺蝶科(Nymphalidae)，1864年由Behr建立，是蛺蝶科中較大的亞科之一，多數為中型或大型種類，主要分布在東洋區、新北區、古北區、新熱帶區、埃塞俄比亞區及澳洲區，按最新的分類研究結果，全世界共有46個屬808種左右，中國有其中的18個屬共114個種，主要分布于我國南方的廣大地區，和大多數蝶類一樣，該亞科的形態學分類問題一直存在著爭議，不同的研究者認為它們可能是一個多系群或并系群，線蛺蝶亞科的分子系統學等方面的研究在我國還是空白，國外的相關研究也十分少見，

蝶類所蘊含的多樣性信息在無脊椎動物中是十分豐富的，并一直作為進化生物學和生態學研究的模型系統之一，隨著分子生物學的迅速發展，多種DNA分析方法被用來研究不同類群、物種和種群間的遺傳差異，其中線粒體基因是常用的目的基因，近十幾年來，許多學者利用mtDNA(mitochondrial DNA)基因對昆蟲綱內不同分類階元之間系統發育關系進行了大量的研究，這些研究中所選取的目的基因，其中COI(cytochromeoxidase subnit I)基因的應用頻率是較多的，目前，運用該基因研究蝶類的系統發生關系已有一些報導。

本研究測定了線蛺蝶亞科7屬18種的線粒體COI基因部分序列，并從GenBank下載了該亞科4屬4種的同源序列片段，通過該基因的比較和分析，重建該亞科的分子系統樹，并據此探討了該亞科的系統發生關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用昆蟲標本均為2005年采集的新鮮標本，樣品采集后立即放入75％酒精中固定，帶回實驗室后放入-20℃冰箱保存，材料來源和時間見表1。

1.2 基因組DNA的提取與擴增

采用蛋白酶K-玻璃粉法提取和純化基因組DNA，具體方法參照Hao et al，合成后生動物COI基因的一對通用引物，序列為：

L1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′；

H2198：5′-TAAACTYCAGGGTGACCAAAAAAT-3′，

該引物可特異擴增mt DNA的COI基因(約650 bp)片斷，引物合成由上海博彩生物技術有限公司完成。

PCR反應的總體積為50IxL，反應體系包括：10×buffer 5.0μL，25mmol/L的MgC1² 7.0μL，0.2g/L的BSA 5.0IxL，0.25mmol/L的dNTPs1.25μL，10μmol/L引物各1.5μL，1.0U Taq酶及2μL(含10－25ng DNA)模板溶液，擴增條件為：94℃預變性5min，按下列參數進行35個循環：94變性1min，47℃退火1min，72℃延伸1min 30s，最后一個循環結束后，72℃總延伸10min，PCR產物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經純化試劑盒純化后，在ABI-377型測序儀上直接測序(由大連寶生物工程有限公司完成)。

1.3 DNA序列數據處理及分子系統樹的重建

對本研究測定了線蛺蝶亞科的18個種，并從GenBank上下載了該亞科4種、秀蛺蝶族2種及蛺蝶亞科一種的COI相應序列片斷見表1，用Clustal X(1.8)軟件該基因序列及氨基酸序列進行比對，基于Kimura-2－parameter模型，采用分子進化遺傳分析軟件Mega3.1計算不同序列間的可變位點、簡約信息位點、轉換顛換比值、對遺傳距離及各堿基含量，由軟件DAMBE分析序列間的不同特質，如不同密碼子位點的轉換與顛換比及轉換、顛換和遺傳距離之間的關系。

用Mega3.1鄰接法構建NJ樹及Paup4.0b10最大簡約法構建MP樹，對NJ樹和MP樹分別進行了內部分支檢驗與1000次bootstrap檢驗分析，來確定各支系的置信度，用MrBayes2.01構建貝葉斯樹，替換模型參數設置為nst=6(GTR模型)位點間速率設置為retes=gamma，建立4個馬爾科夫鏈，以隨機樹為起始樹，共運行200000代，每100抽樣一次，重復一次，在舍棄老化樣本后，根據剩余的樣本構建一致樹，將所得結果進行統計，獲得系統樹的支系結構以及各支系的后驗概率。

2 結果

2.1 COI基因序列組成及變異

共測定了蛺蝶科線蛺蝶亞科3個族18個種的線粒體COI基因的部分序列，已提交Gen-Bank，登陸號見表1，所選外類群為蛺蝶亞科的枯葉蛺蝶。秀蛺蝶亞科的電蛺蝶和素飾蛺蝶，本研究所測序列與GenBank中下載的4種線蛺蝶亞科蝶類的同源序列進行比對并處理后的總長度為645bp，其中有199個可變位點，147個信息位點，各堿基的平均含量及3個不同密碼子位點的變異及信息位點數比較見表2，從表2可以看出，該基因表現出明顯的A+T含量(平均69.6％)偏斜，就每個氨基酸密碼子來看，堿基組成在不同位點差異很大，第3位點的A+T含量很高，達到92.5％。

用MEGA軟件對線蛺蝶亞科物種的氨基酸組成進行分析，在645 bp的核苷酸序列所編碼的215個氨基酸中，有18個變異位點，7個信息位點，其中環蛺蝶族與其它幾個族區別稍多，在116位點，環蛺蝶族與其它族不同，在95位點，環蛺蝶族與擬縷蛺蝶相同為蘇氨酸，而其它均為天冬氨酸；114位點上，環蛺蝶族與翠蛺蝶族相同，線蛺蝶族中的回線蛺蝶和重眉線蛺蝶的氨基酸與秀蛺蝶族相同，另外有3個物種的氨基酸變異數目相對較多，分別是回線蛺蝶、麗蛺蝶及擬縷蛺蝶。

統計兩兩序列間堿基替換數和遺傳距離之間的關系見圖1，平均轉換／顛換比接近1，分析發現，大部分序列第3密碼子位點的轉換／顛換比小于1，表明轉換在此位點已達飽和，這與以前的一些研究是相似的，這種現象提示高水平的平行演化現象的發生，將第3密碼子除去，第1和第2密碼子的轉換／顛換比則超過1(平均5.397)，對于這種現象的處理，一些研究者們建議將第3密碼子去除，或進行加權分析，分別對轉換和顛換賦予不同的權重，本文為了估計COI第3密碼子的轉換的高飽和率在線蛺蝶亞科系統發育分析中的影響，將第3密碼子去除與保留該位點進行比較分析，遺傳距離在內群和外群之間的最大值為16.3％，最小為12.1％，內群序列間的平均遺傳距離為10.8％。

圖1看出當遺傳距離較小時，轉換的數值(Ts)明顯高于顛換的數值(Tv)，隨著遺傳距離(p)的增加，轉換的數目會暫時處于一個較為恒定的狀態(達到飽和)，而顛換數呈持續上升趨勢(超過轉換值)，從而導致轉換顛換比值明顯下降，當遺傳距離增加很大時，轉換數又開始增加，總之，本研究的Tv、Ts和p值之間呈現出良好的線性關系。

2.2分子系統樹

本研究共構建了4種樹：NJ(Neighbor-ioining)樹、貝葉斯樹(bayesian tree)、MP(Maximum parsi-nomy)樹及去除密碼子第3位點的MP樹，構建的NJ樹如圖2，貝葉斯樹如圖3所示；由于第3密碼子位點的轉換出現了飽和，因此，構建了全部位點的MP樹(TL=572，CI=0.4930，RI=0.6033)和去除第3密碼子的MP樹(TL=94，CI=0.5319，RI=0.7067)，但這兩種樹拓撲結構非常相似(限于篇幅，本文未顯示)，NJ樹和這兩種MP樹的拓撲結構也很相似，主要差別在于擬縷蛺蝶和細刺櫟蛺蝶的位置有所不同，對這4種樹進行綜合比較，以NJ樹為例，可將內群分為3個支系：第1個支系由麗蛺蝶族的麗蛺蝶組成；第2個支系由線蛺蝶族線蛺蝶屬、悌蛺蝶屬、帶蛺蝶屬和擬縷蛺蝶屬相聚而成，其中，帶蛺蝶屬和悌蛺蝶聚成一簇，線蛺蝶屬聚成一簇(上述2簇互為姊妹群)，它們聚類后再和擬縷蛺蝶屬聚在一起；第3個支系包括翠蛺蝶族的翠蛺蝶屬、櫟蛺蝶屬以及環蛺蝶族的環蛺蝶屬和裴蛺蝶屬，其中，幾種環蛺蝶類聚成一簇(菲蛺蝶位于其內)，幾種翠蛺蝶聚成一簇，而櫟蛺蝶和以上2個聚類簇構成該支系的3個小支系。

3 討論

3.1 COI基因序列

通過對所測得的COI基因部分序列進行分析，結果表明，A、G、C和T的堿基平均含量分別為29.6％、14.7％、15.7％和40.0％，A+T平均含量為69.6％，C+C平均含量為30.4％，與其他文獻報道的昆蟲線粒體基因組的結果較為一致，貝葉斯法的分析結果表明，在6種堿基替換類型中，C和T間的替換速率最高，其次是A和C，A和G間替換，Mega軟件所分析的序列數據組的平均轉換／顛換比值為0.958，即顛換值比轉換值平均要高，之所以會出現這種結果，可能有以下幾種原因：首先，某些位點發生了多次轉換替代(替代飽和)，然而，越來越多的研究表明，飽和問題并不是在進行簡約性分析時推導系統發育關系的障礙，其次，Crozier等(1992)認為高A+T含量與氨基酸序列變異沒有顯著的相關性，但一些學者卻認為高A+T含量會增加AT顛換的可能性，因而導致第3位點顛換速率增加，本研究中，翠蛺蝶族及線蛺蝶族物種的平均A+T含量分別為70.2％和69.8％，第3位點A+T為94.2％，94.7％，均高于所有類群平均含量，而環蛺蝶族則相對較低；從單個物種來看，之前分析的氨基酸變異較多的擬縷蛺蝶及回環蛺蝶的A+T含量并不是很高，只有麗蛺蝶較高，因而我們支持Crozier等的觀點。

3.2 線蛺蝶亞科是否可以作為一個獨立的亞科

近年來國外的生物學家們對于蝴蝶的系統發育研究越來越多，并據此提出了不同的分類系統，有關線蛺蝶亞科較早的分類是由Harvey(1991)基于幼體形態特征而提出，他認為線蛺蝶亞科是一個“非自然”的集合，是一個多系群；Ackery等(1999)也持有相同的觀點。

他們將線蛺蝶亞科劃分為5個族，包括線蛺蝶族、朱履蛺蝶族Biblidini、絲蛺蝶族Cyrestini、秀蛺蝶族Pseudergolini及黃肱蛺蝶族Coeini，其中的線蛺蝶族即本文研究的線蛺蝶亞科，隨后，Fre－itas(1999)基于成體和精子形態學特征得出了不同的結論：將朱履蛺蝶族從線蛺蝶中分開，而將黃肱蛺蝶族則納入蛺蝶亞科，隨著分子系統學在蝶類的系統分類研究中的運用，蛺蝶類的相關研究取得了一些新的進展，Brower(2000)基于wingless基因的研究結果顯示朱履蛺蝶族與蛺蝶亞科的關系比較接近；最近的研究也表明朱履蛺蝶族、絲蛺蝶族、秀蛺蝶族及黃肱蛺蝶族都應從線蛺蝶亞科中分離出來；Wahlberg等(2003)的研究進一步建議將絲蛺蝶族和秀蛺蝶族合并為絲蛺蝶亞科；周堯(1998)的分類系統也將上述4族與線蛺蝶亞科分開，綜合形態學及最新的分子證據，我們認為Harvey(1991)分類中的線蛺蝶族應該脫離出來以一個獨立的亞科而存在，即線蛺蝶亞科。

3.3 線蛺蝶亞科內的系統發育

本研究中共包括線蛺蝶亞科4個族，這些族的劃分及所包含的屬是基于形態特征劃分的，在這4個族中，有3個族所選用的標本包括2個或2個以上屬，分子系統樹上這幾個族所含種類基本上分別聚在一起，形成單元族，只有櫟蛺蝶屬、縷蛺蝶屬的位置在幾顆系統樹上并不一致。

上述4族中，環蛺蝶族在早期是獨立于線蛺蝶亞科之外的，Eliot(1978)和Amiet(2000b)也認為應將環蛺蝶族從線蛺蝶亞科中分離出來，然而Willmott(2003)的研究結果還是支持將其納入線蛺蝶亞科，本研究中仍將該族置于線蛺蝶亞科中，結果顯示該族的物種相聚在一起，并且有較高的自展值和后驗概率的支持，其中，該族菲蛺蝶屬的柱菲蛺蝶位于環蛺蝶屬物種的中間，表明這兩個屬有非常近的親緣關系，從形態學上來看，2者的主要差別在于：柱菲蛺蝶的翅面斑紋白色，中室條紋與側條及橫帶下段不愈合；而環蛺蝶屬的翅正面黑色，有淡色斑紋，除前翅中室縱條紋外，前后翅的斑紋連成2重的環，但其他的形態性狀較為相似，因此也有學者將菲蛺蝶屬歸入環蛺蝶屬，因而筆者也傾向于支持將菲蛺蝶屬納入環蛺蝶屬，關于翠蛺蝶族，Amiet(2000a)通過對該族形態學共源性狀的研究，認為它們應該為一個單系群，而本研究結果顯示：NJ系統樹上，其中的櫟蛺蝶屬為翠蛺蝶屬3個種類的旁系群，而包含第3密碼子的MP樹上該屬與翠蛺蝶屬關系則較遠，從遺傳距離上來看，細刺櫟蛺蝶與翠蛺蝶屬物種及其它屬物種間的遺傳距離差別不是很大，因而我們的結果并不支持他的觀點。

線蛺蝶族自建立以來，其分類地位一直沒有多大變動，該族是一個較大的類群，它的單系性似乎是毋庸質疑的，在本研究所構建的NJ樹上，該族的四個屬聚在一起形成單系群，而在貝葉斯樹上擬縷蛺蝶與環蛺蝶族的關系較接近，從氨基酸序列分析來看，擬縷蛺蝶在某些變異位點上與環蛺蝶族更為相似，縷蛺蝶屬為我國特有的屬，在Harvey(1991)的分類系統中是放在線蛺蝶屬中的，而周堯(1998)則將它從線蛺蝶屬中分開，從遺傳距離來看，線蛺蝶屬內物種間的遺傳距離在0.039與0.068之間，而擬縷蛺蝶與線蛺蝶屬的最小遺傳距離是0.127，NJ樹上它與線蛺蝶族其它類群相聚的自展值也較小，因而筆者傾向于將縷蛺蝶屬從線蛺蝶族中獨立出來，帶蛺蝶屬的玉杵帶蛺蝶和幸福帶蛺蝶兩者的COI基因變異位點不超過2個，遺傳距離很小(0.002)，形態上它們的關鍵區別特征是：玉杵帶蛺蝶前翅近頂端有3個白色小斑，中橫帶與外橫帶不接觸，而幸福帶蛺蝶前翅近頂端有2個白色小斑，中橫帶與外橫帶在前緣相連，兩者的形態區別似乎又可以將它們劃分開來，而且幸福帶蛺蝶為我國特有種，是否可以將它們合為一種，尚期待更多的基因與形態學的聯合分析，值得一提的是，本文來自海南的相思帶蛺蝶則與線蛺蝶屬聚在了一起，從形態上來看，這兩個屬也是很相似的，可否將其歸入線蛺蝶屬還值得進一步探討，目前，一些學者也逐漸地將表現型獨特的物種從線蛺蝶屬中移走，如回線蛺蝶和重眉線蛺蝶等，他們認為該屬可能是并系的，從我們的研究看，回線蛺蝶的氨基酸變異位點相對較多，分子系統樹上也顯示回線蛺蝶和重眉線蛺蝶與其他線蛺蝶相對距離較遠，總之，該族的系統學研究還需要大量的分類單元和不同基因數據的介入。

Willmott(2003)的形態學分支分析結果認為麗蛺蝶族是線蛺蝶亞科中最早分化出來的類群，其次是環蛺蝶族，本研究結果顯示，麗蛺蝶族的位置基本上是處于系統樹的基部，是該亞科較早分化出來的類群，而線蛺蝶族早于環蛺蝶族從該亞科中分化出來，環蛺蝶族與翠蛺蝶族則可能是較晚分化的類群。

致謝：西北師范大學龔大杰教授協助采集部分標本，在此深表謝意！

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。