ＲＮＡ干擾ＶＥＧＦ對體外ＪＡＲ細胞生長的影響

摘 要：利用pSUPER質粒作為載體，在人絨癌JAR細胞內成功的沉默了VEGF基因的表達，建立了穩定轉染pSUPER-shVEGFl，pSUPER-shVEGF2干擾質粒的JAR細胞株．隨后利用RT-PCR證實了在JAR細胞株中，VEGF基因的表達被抑制，顯微觀察及流式細胞學檢測轉染后細胞株克隆生長情況顯示體外培養條件下VEGF基因受抑后JAR細胞生長周期無發生變化，提示VEGF在體外可能對JAR細胞增殖無直接作用。

關鍵詞：RNA干擾；血管內皮生長因子；JAR細胞；pSUPER載體

中圖分類號：R34

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)0l－0072-06

血管內皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor.VEGF)是一種作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子，具有強有力的血管生成與新生作用，與腫瘤生長密切相關RNA干擾(RNAinterference.RNAi)是指當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA(double-strandedRNA.dsRNA)時特異性阻斷該基因表達的現象，RNAi技術能使人類快速了解生物體內某基因的功能，同時它的基因特異阻斷特性為基因治療提供了有益的探索，本研究利用RNA干擾技術，抑制或沉默來自于絨癌滋養細胞JAR細胞株的VEGF的表達，研究體外VEGF對于JAR細胞生長的影響，旨在探討VEGF在惡性腫瘤中的作用機制，為惡性腫瘤的病理機制及治療提供線索．

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 人絨癌JAR細胞株

購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫，常規培養于含10％小牛血清的RPMI-1640培養液中。

1.1.2 主要試劑

逆轉錄試劑盒購自Promega公司；RPMI-1640培養基，pUC Mix marker為上海生工生物工程技術服務有限公司產品；Lipofectamine^TM2000脂質體和Fugene6轉染試劑購自Invitrogen公司MiniBESTPlasmid Purification Kit，HindⅢ、EcoR I限制性內切酶，Taq DNA聚合酶購自TaKaBa公司；大腸桿菌DH5α，JM109由中南大學腫瘤研究所惠贈；pMD18-T載體購自TaKaBa公司；pSUPER.retro質粒，即pSUPER逆轉錄病毒載體由OligoEngine公司生產，帶有HI-RNA啟動子序列。HindⅢ及EcoR I酶切位點，具有氨芐和嘌呤霉素抗性，如圖1。

1.2 方法

1.2.1 VEGF寡核苷酸序列的設計

根據文獻查詢及實驗目的，參照其他成功者的經驗，上游引物應用5′端通用引物，攜有HI啟動子起始區及EcoR I酶切位點；為確保RNA干擾成功，下游引物設計兩對VEGF特異性序列，分別稱為Vla、Vlb及V2a、V2b，為19nt核苷酸的正向插入序列及反向互補序列，中間被9個堿基(100p區)分開，克隆后可組成短發夾結構，根據pSUPE.retro載體結構，下游引物攜有HI啟動子的末端區序列及HindⅢ酶切位點接頭，中間插入BglⅡ的酶切位點；短發夾VEGF(short hair-pin VEGF，shVEGF)目的序列的5′端第一個堿基設計為G，啟動子下游的酶切位點下方緊連一個C，使插入片段和啟動子有一定空間間隔，以確保轉錄的發生．

1.2.2 RNA干擾質粒的構建

1.2.2.1 PCR

分別以Primer 1和Primer Vla及Primer 1和Primer V2a為上下游引物，以pSUPER．retro為模板進行第一輪PCR．將第一輪PCR產物稀釋100倍，分別取1μL作為模板，再分別以Primer 1和Primer Vlb及Primer V2b為引物進行第二輪PCR.HI Promoter區218 bp，第一輪PCR產物252bp，第二輪PCR產物298 bp.PCR的反應體系：10 x reaction buffer 2μL，模板DNA 1μL，上游引物(10μmol/L)0.4μL，下游引物(10μmol/L)0.4μL，dNTPs(2mmol/L)0.4μL，Taq酶1U，加ddH₂O至20μL．反應條件：94℃預變性30s、62℃退火30s、72℃延伸40 s，30個循環，72℃延伸10min，第一輪PCR產物擴增出HindⅢ酶切位點，H1啟動子區域、BgtⅡ酶切位點、VEGF的正義鏈序列及loop區；第二輪PCR，擴增出具有H1啟動子區域并帶針對VEGF的發夾RNAi片段產物，且在它們之間有一個BglⅡ酶切位點，兩端帶有EcoR 1和HindⅢ酶切位點。

1.2.2.2 TA克隆

將上述經2％的瓊脂糖驗證的PCR產物用于以下連接．反應體系為：pMDl8-T載體1μL，PCR擴增的產物0.4μL，T₄連接酶Bufer(10×)1μL，T4DNA連接酶(3u/μL)1μL，加ddH₂O至20μL.22℃水浴連接1h，挑選陽性克隆，取1μLJMl09大腸桿菌菌液做PCR鑒定是否攜帶目標片段，將鑒定好的克隆和上下游引物一并送上海博亞生物技術公司AB1377型全自動測序儀測序．

1.2.2.3 質粒抽提與雙酶切

按說明書抽提氨芐青霉素篩選后的JMl09大腸桿菌質粒，行雙酶切．將pSUPER.retro質粒和TA克隆產物分別用EcoR I和HindⅢ雙酶切，酶切體系分別為：10×Y⁺/Tang^TMBuffer 4μL，EcoR 1限制性內切酶1μL，HindⅢ限制性內切酶1μL，TA克隆產物或pSUPER空載體質粒DNA 8μL，加五蒸水至20 μL，37℃酶切反應3h，100℃水浴滅活限制性內切酶，分別取1μL行2％瓊脂糖凝膠電泳(0.5×TEB，5V/cm)，瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外燈下仔細切取所需目的條帶，放入一干凈的2mL試管內，按說明書行膠回收。

1.2.2.4 連接反應

將已酶切的pSUPER.retro空載體質粒與TA克隆酶切后的目的片段進行定向連接，反應體系：pSUPER.retro酶切片斷1μL，TA克隆酶切片段3μLT⁴連接酶Bufer(10×)5μL T4連接酶(3u/μL)1μL加雙蒸水至20μL，16℃水浴12h，連接反應后形成攜帶短發夾結構VEGF的RNA干擾質粒，即pSUPER-shVEGF1和pSUPER-shVEGF2，經感受態大腸桿菌DH5a克隆擴增，提取質粒備用。

1.2.3 JAR細胞的分組

組1：空白對照(未轉染JAR細胞)組；組2：轉染空pSUPER載體的細胞組；組3：轉染含shVEGF1片段的pSUPER載體細胞組；組4：轉染含shVEGF2片段的pSUPER載體細胞組。

1.2.4 陽離子脂質體法轉染細胞

轉染前24h將JAR細胞按2×105接種于6孔板中培養，待細胞生長至約80％融合度時棄培養基，用不含血清的RPMI－1640液洗滌細胞2次，在微量離心管中準備A1、A2、A3、B1、B2及B3液，A1、A2、A3液均為：250μL RPMI－1640液+5μLlipofectamine^TM 2000；B1液：250μL RPMI－1640液+3μg空載體質粒；B2液：250μL RPMI-1640液+3μg shVEGF1載體質粒；B3液：250μL RP-MI－1640液+3μg shVEGF2載體質粒，將A1+B1，A2+B2，A3+B3液混合置室溫下半小時后，分別加入0.8 mL RPMI－1640液，將A1+B1昆合液均勻滴加在組2細胞表面，A2+B2混合液均勻滴加在組3細胞表面，A3+B3混合液均勻滴加在組4細胞表面，組1細胞表面滴加RPMI-1640液，4組細胞37℃，5％CO²培養箱中培養6h，棄去轉染液，換不含抗生素的完全培養液，培養36－48h．

1.2.6 嘌呤霉素篩選

轉染48h后，用胰酶消化，傳代培養，使細胞長至80％時，用0.8mg/L嘌呤霉素篩選，篩選10－14d，培養液中出現單克隆細胞株，挑單細胞株，繼續嘌呤霉素擴大培養，每天應用倒置顯微鏡觀察各組目的細胞的大小、形態、核漿比例及生長方式上的變化，并照相。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞周期

收獲2×10⁶個細胞，PBS漂洗2次后，4℃70％乙醇固定30min，離心，棄乙醇，取500μLPBS液重懸細胞，加入RNaseA至終濃度100mg/L，37℃水浴30min，碘化丙啶(PI，20mg/L)染色30min，將組2，組3送流式細胞學檢測，利用ModFit LT軟件分析細胞周期．

1.2.8 RT-PCR檢測各組JAR細胞中VEGF的基因表達

應用primer premier5.0軟件設計VEGF及內參照β－actin引物，VEGF引物的擴增片段長度為534bp，內參照β－actin擴增產物片段長度為155bp，設計后交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，VEGF上游引物為5’－TcTrCAAGCCATCCTGTGTG-3′，下游引物為5’－ATCTGCATGGT－GATGTI'GGA-3′；看家基因β—actin的上游引物為：5′GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA3′，下游引物為：5′－AGAAAATCTGGCACCACACC3′。

因組1細胞在篩選中不能耐受嘌呤霉素而全部死亡，另取JAR細胞作為VEGF轉染前對照，代替組1，取組1、組2、組3、組4細胞各3瓶，分別提取總RNA，RT-PCR檢測各組細胞VEGF基因的表達，PCR反應條件為：95℃預變性1min 30s，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，然后再延伸5min，4℃終止反應．其間擴增5個周期時加看家基因β－actin引物．重復RT-PCR步驟3次，分別取RT-PCR產物1μL，2％瓊脂糖凝膠電泳驗證RT-PCR產物片段大小，EB染色，紫外凝膠攝像儀下觀察照相，計算機掃描分析，以灰度為單位，VEGF/β－actin的灰度比作為每例標本VEGF的相對表達量。

1.2.9 數據分析

實驗數據以±s表示，采用t檢驗進行統計學分析。

2 結果

2.1 轉染后細胞的生長情況

嘌呤霉素篩選后1－4d，組2、組3、組4部分細胞開始變性壞死，但剩余細胞似失去接觸抑制，表現為成堆生長，空白對照組細胞大部分死亡；篩選后11－12d，空白對照組細胞全部死亡，其余各組開始長出新的單克隆．經過近1月篩選后，除空白對照組外，均得到單克隆細胞株，說明轉染成功，觀察顯示各組獲得的單克隆細胞株仍平鋪成片生長，可見大量分裂像，三組單克隆細胞生長情況相似。

2.2 轉染后JAR細胞株VEGF的基因表達

RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2，產物特異性好，可見VEGF和內參照β－actin擴增片段，未見其它擴增產物，與內參照相比，轉染前JAR細胞及轉染空pSUPER載體質粒組VEGF均呈強表達，轉染shVEGF2組的VEGF表達條帶明顯較弱，shVEGF1組未見VEGF表達條帶，轉染空載體pSUPER載體質粒組VEGF平均相對表達量與空白對照組相比無明顯差異，t=0.68，P=0.50>0.05：與轉染空pSUPER載體質粒組相比，轉染pSUPER-shVEGF1載體組及轉染pSU-PER-shVEGF2載體組VEGF表達明顯減少，t值分別為19.97、16.44，P值為0.00<0.05。如表1

2.3 轉染后細胞周期的流式細胞學分析

流式細胞學分析結果顯示轉染pSU-PER-shVEGFl載體組的各期細胞比例為：％G162.4％：％G2 15.5％；％S 22.1％；轉染空pSU-PER載體組各期細胞比例為％G1 66.2％；％G212.7％：％S 21.1％，兩組各期細胞比例無明顯差異，如圖3。

3 討論

3.1 pSUPER表達載體的構建

pSUPER siRNA systerm是利用人RNAⅢ型聚合酶H1 RNA啟動子構建的、可在哺乳動物細胞中快速拷貝轉錄小片段RNA(<400 nt)的質粒載體，H1啟動子轉錄起點明確，轉錄終止以5個連續的胸腺嘧啶(T)為信號，pSUPER載體還具有HindⅢ，BglⅡ，EcoR I酶切位點，適合于將帶有5′端Hl啟動子和3′端HindⅢ接頭的兩個互補的寡核苷酸序列插入．pSUPER siRNA sys.term最早由Brumelkamp等報道，這種載體能在哺乳動物細胞內指導siRNA的合成，持久、有效、特異地下調基因表達，引起序列特異性基因封閉，導致靶基因的功能喪失，本實驗采用pSUPER質粒攜shVEGF的RNA干擾片段轉染人絨癌JAR細胞，因pSUPER質粒具有嘌呤霉素抗性基因，經過嘌呤霉素篩選，成功獲得了新的克隆，在繼續嘌呤霉素篩選壓力下，獲得了穩定轉染shVEGF1和shVEGF2的重組pSUPER質粒及攜空pSUPER質粒的JAR細胞株，經過RT-PCR檢測，穩定轉染pSUPER-shVEGF1、pSUPER-shVEGF2的JAR細胞株VEGF基因表達受到了有效抑制，pSU-PER-shVEGF1組達到了VEGF基因沉默的效果，而未載有shVEGF的空pSUPER轉染組的細胞仍顯示VEGF條帶，與未轉染的細胞相似．提示本實驗構建的質粒能穩定抑制VEGF mRNA表達，且成功建立了穩定轉染VEGF質粒的JAR細胞株．其機制據Brummelkamp的研究，pSUPER載體系統不僅在RNA干擾中作為siRNA的載體，還可以在哺乳動物細胞內，以自身載有的siRNA為模板，復制產生新的特異性的siRNA的正義鏈與反義鏈的前體，并由于其配對特性，快速合成為siR-NA，發揮強而持久的RNA干擾作用。

3.2 VEGF靶位點與RNA干擾效果

本實驗在設計siRNA時，設計的序列為兩組，shVEGF1序列的RNA干擾效果較好，而shVEGF2序列RNA干擾后，VEGF表達減少，但未被完全抑制，這可能和靶位置有關，這和Holen等的研究相似，Holent等發現在Hela細胞中，針對人凝血組織因子mRNA編碼區設計的siRNA，其靶位點相互之間僅相差幾個堿基(靶位點左右平移)，RNA干擾的抑制效應就表現出明顯的差異，甚至效率相差超過50％，為避開位置效應的影響，在siRNA的設計時，要求盡量多選幾個候選靶位點，來達到利用RNA干擾抑制目的基因表達的實驗目的。

3.3 VEGF在滋養細胞中的作用

VEGF是一種能產生多種效應的細胞因子，其生物學功能主要為促進血管的生成與增殖，促進內皮細胞的遷移，增加血管的通透性．VEGF除了在血管內皮細胞發揮作用外，在其他代謝旺盛的組織細胞中也有表達，如腎上腺皮質細胞、胚胎組織、垂體細胞及腫瘤細胞等，在病理條件下，特別是在惡性腫瘤細胞中，VEGF無論是在mR-NA水平還是在蛋白水平均有過量表達，

目前認為VEGF有促進滋養細胞增殖的作用，有研究顯示，從妊娠開始，母體外周血血清中VEGF含量持續增高，7周時達到高峰，以后維持高水平，Chamock-Jones等在滋養細胞樣絨毛膜癌細胞系(BeWo細胞)通過原位雜交方法檢測到VEGF受體Flk-1和Flt-1 mRNA呈高強度表達，體外實驗發現，用VEGF165處理的BeWo細胞有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶活化刺激細胞增殖作用與VEGF165呈劑量依賴關系．另采用滋養細胞株SGHPL-4體外侵入模型研究發現，與血管發生有關的細胞因子，尤其是血管內皮生長因子(VEGF)，可以增加滋養層細胞的運動性，可能參與滋養細胞的侵入，但也有研究顯示，在培養的絨毛外滋養細胞株和BeWo絨癌細胞株中加入VEGF121可以促進滋養細胞增殖，此效應可以被VEGF抗體所阻斷，加入VEGF165后無直接增殖活性，加入硫酸乙酞肝素糖蛋白(HSPGs)處理后的VEGF165方產生增殖效應，但VEGF的兩種亞型VEGF165和VEGF121，對滋養層細胞的遷移和侵入均無作用，且滋養層細胞受VEGF增強的遷移力并不具有方向特異性，僅表現為雜亂無序的運動，并不利于其侵入，甚至對滋養層細胞的侵入具有抑制作用。

本研究觀察RNA干擾VEGF基因表達前后細胞的生長情況顯示，未轉染質粒組，因不能耐受嘌呤霉素的壓力而死亡，其他各組JAR細胞表面粗糙，表現為成堆生長，似失去接觸抑制，是否與VEGF基因沉默后細胞間信號傳遞的改變有關尚需進一步探討，不排除轉染過程中陽性脂質體附著于細胞表面，致細胞表面電荷改變所致，因為各轉染質粒組分別長出新的單克隆后，單克隆細胞仍呈平鋪成片生長，流式細胞學檢測轉染pSU-PER-shVEGF1組與轉染空載體組相比，細胞增殖無明顯差異，這與Lala等報道的VEGF可促進絨毛外滋養細胞的增殖及Chamock-Jones所報告的VEGF促進滋養細胞樣絨毛膜癌細胞系(BeWo細胞)的增殖不同，由此我們推斷，血管內皮生長因子對于滋養細胞增殖作用的條件尚需進一步研究，VEGF對滋養細胞的增殖作用可能為間接作用，即通過對滋養細胞周圍環境，如促進血管生成與新生作用，從而改善滋養細胞的營養而促進滋養細胞的發育與分化，此需要進一步的研究。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。