浮游病毒的電鏡觀察

摘要：直接用戊二醛固定水樣中的浮游病毒，通過超速離心使已固定的浮游病毒沉淀到覆有Formvar膜和碳支持膜的銅網上，經醋酸雙氧鈾染色后，利用透射電鏡對湖水中的浮游病毒進行觀察，結果可觀察到球形、桿狀和蝌蚪狀等形態各異的浮游病毒顆粒及球形病毒的囊膜子粒、桿狀病毒的核衣殼、具有不同尾部的蝌蚪狀病毒等的精細超微結構，從而建立了一種簡便、快捷和高效研究浮游病毒的電鏡方法。

關鍵詞：電鏡觀察；浮游病毒：超微結構

中圖分類號：Q939.48

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)01-0048-04

電鏡技術已廣泛用于病毒的形態特征、分子結構以及與宿主細胞相互作用的研究，電鏡觀察可為病毒的形態、超微結構及分類定位提供最直觀的依據，但要通過電鏡對水樣中的病毒進行觀察，通常必須對水樣進行濃縮和病毒分離，

浮游病毒是存在于水體中的病毒，浮游病毒也是指水生態系統中的病毒，目前被普遍認為是水體微生物群落中豐富且重要的活性成分，它能調節水體中異養細菌，藍藻和真核藻類的物種多樣性和生物產量，影響生物地化循環，介導水生態系統中微生物之間的基因轉換，對水環境乃至整個生態系統都具有重要影響，因此受到人們的廣泛關注，近些年已有報道指出，浮游病毒存在不同的形態類群。

從水樣中分離濃縮病毒，不僅過程繁雜、耗時長、費用高，還會使水樣中病毒的數量及完整性受損，可否免去分離濃縮程序，直接對水樣中的浮游病毒進行制樣和電鏡觀察呢?因此，本文著重對水樣中浮游病毒樣品的不同制備方法及電鏡觀察效果進行比較。

1 材料與方法

1.1 水樣的采集

將取樣器浸入武漢東湖水面以下10cm處取出水樣，裝入收集瓶內，立即加入戊二醛(按體積比水樣：戊二醛=9:1，使之終濃度為2.5％)進行固定，并迅速將固定后的水樣置于4℃冰箱內保存，備用。

1.2 制樣

方法之一：水樣直接滴到銅網上，采用常規的滴染法，即把水樣直接滴在覆有Formvar膜和碳支持膜的銅網上，使形成一小液珠，放置片刻，用濾紙條吸去多余的液體，自然干燥。

方法之：水樣經超速離心到銅網上，參照劉艷鳴等的方法(2005)，以25000r/min離心3h，使病毒沉淀到銅網上，棄去上清，空氣干燥，

1.3 染色

醋酸雙氧鈾染色，在蠟盤中滴加2％的醋酸雙氧鈾，然后將上述干燥好的銅網漂浮在染液上，染色2－3min。

磷鎢酸染色，將2％的磷鎢酸滴加到蠟盤中，將上述干燥好的銅網插入其中，染色2－3min，

1.4 電鏡觀察

在JEM－1230型透射電鏡下觀察，加速電壓為100kV，利用GATAN INC CCD圖像傳輸系統，獲得電鏡圖片。

2 結果

2.1 制樣方法對觀察效果的影響

我們分別采用了兩種制樣方法和兩種染色方法。結果顯示：不同的制樣和染色方法對電鏡觀察效果有明顯的影響。

利用方法一所制備的樣品，無論經醋酸雙氧鈾染色，還是磷鎢酸染色，都存在雜質多，背景暗，而病毒顆粒少的情況，甚至許多視野看不到病毒顆粒，可見，該方法不適宜制備浮游病毒的樣品。

利用方法二所制備的樣品，經磷鎢酸染色后，整個圖像背景雜亂，病毒顆粒分布不均勻，形態模糊，該方法也無法對水樣中的浮游病毒進行準確觀察。

同樣利用方法二所制備的樣品，經醋酸雙氧鈾染色后，可觀察到大量形態和數量不同的病毒顆粒，因此該方法可有效用于浮游病毒的形態觀察及計數分析，下述電鏡圖片均是通過該方法得到的。

2.2 浮游病毒的種類、形態及精細結構

用方法二所制備的浮游病毒樣品，在透射電鏡下，不僅可清晰地觀察到病毒顆粒的形態，如球形、桿狀和蝌蚪狀等(圖1)，還能了解其部分精細結構，包括球形病毒的子粒、桿狀病毒的核衣殼(橫紋狀結構)和蝌蚪狀病毒的尾髓等(圖2)。

2.3 浮游病毒的計數分析

在進行樣品觀察時，可以根據需要來調節電鏡的放大倍數，如要了解病毒的精細結構時，可將放大倍數調節到8－10萬倍；如要對水樣中的浮游病毒進行計數分析，就將放大倍數調低至2萬倍左右，在此條件下，視野較寬，病毒的形態及數量都清晰觀察到(見圖1B)。

3 討論

我們采用了不同的制樣和染色方法，對水體中的浮游病毒進行觀察，結果顯示，常規的直接滴染法雖然簡便快捷，但由于浮游病毒在水體中的含量與分離或純化后的樣品相比，其量相對較少且分布不均勻，圖像背景雜亂、不清晰，故很難獲得滿意的電鏡圖片，其原因可能是浮游病毒和水中的其它浮游生物、細胞碎片等固體雜質混在一起，吸附到銅網上，對病毒形態的觀察和圖片拍攝造成干擾。

采用超離法制樣，可得較好的結果，這是由于在離心力的作用下，一些比病毒顆粒要大的物質首先沉降到銅網上，并形成一個電子密度高且較均勻的背景，為浮游病毒的觀察起托襯作用，值得注意的是，此方法的離心速度較為關鍵，實驗表明，用25000r/min的轉速(Beckman L-90K超速離心機，SW41轉頭)比較適宜，這是由于用過大的離心速度，就會使有蝌蚪狀病毒的尾巴折斷或損傷；而離心速度過小，則難使體積較小的病毒沉降到銅網上，不能全面真實地反映待檢水體中浮游病毒的形態多樣性及含量等情況，另外，每次離心加入待測水量的多少，要根據水樣中浮游生物、其它懸浮顆粒物的含量以及湖水的富營養化程度等因素來定，在超富營養區的水樣中，細菌、藻類等浮游生物及其它懸浮雜質較多，每次可加入1mL左右的水樣；而來自富營養區的水樣，每次加入1.5mL左右；來自中等營養區的水樣，則要加入2mL左右，這樣才能使離心到銅網上的樣品分布均勻、數量適中，能獲得較好的觀察效果。

用磷鎢酸對浮游病毒進行染色，只產生負染效應，由于它與支持膜的粘附作用很弱，染色后的標本不能久留，因此，常難以觀察到浮游病毒的精細結構，當我們選用醋酸雙氧鈾溶液作為染色劑時，由于醋酸雙氧鈾可產生正染和負染兩種效果，在銅網中雜質多、背景暗的區域可觀察到淺色的病毒顆粒；在淺色的背景下則可觀察到深色的病毒顆粒，因此，處理得當，就能有效觀察到不同背景條件下的浮游病毒顆粒，同時，醋酸雙氧鈾容易與支持膜粘附，產生較強的反差，染色后的標本較穩定，有利于保存。

在建立了適宜浮游病毒制樣和染色方法的基礎上，獲得了不同病毒顆粒形態的圖片、病毒精細結構的圖片，這顯示所建立的方法，能簡便、有效地用于浮游病毒的研究，包括用于浮游病毒的計數分析。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。