肺癌組織和腫瘤細胞系中ＢＲＧ１的表達分析

摘 要：BRGJ(brahma-related gene 1)是進化上高度保守的SWI／SNF染色質重塑復合物的成員之一，研究表明：BRGI具有抑瘤基因的特征，可能與腫瘤的發生發展有關，我們采用RT—PCR、NortherR雜交和Westemblotting證實：肺腺癌細胞系A549和鼻咽癌細胞系HNE2、HNE3、CNE1中無BRG1的表達，而肺鱗癌細胞系NCI—H520、永生化正常人支氣管上皮細胞系HBE和鼻咽癌細胞系HONE1、HNE1、CNE2中有BRGJ的表達，同時，通過RT—PCR檢測10例肺癌組織標本，發現60％(6/10)的肺癌組織中日BRG1的mRNA水平明顯下調，而配對正常肺組織中BRG1，的mRNA表達未見改變，對29例肺癌組織和10例配對正常肺組織切片進行免疫組化染色，結果顯示：肺癌組織中BRG1蛋白表達的陽性率為37.9％(11/29)，配對正常肺組織中BRG1蛋白表達的陽性率為90％(9/10)，兩者的差異有顯著性(P<0.05)，這提示BRG1確實在肺癌組織及多種腫瘤細胞系中表達下調或缺失，在肺癌發病過程中可能起一定的作用。

關鍵詞：BRG1；表達；肺癌；腫瘤細胞系

中圖分類號：R730

文獻標識碼：A

文章編號：1007—7847(2007)0l-0084—06

肺癌是目前全球發病率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的健康和生命，近年來我國肺癌的發病率和死亡率迅速上升，有人預計中國將成為21世紀的肺癌大國，肺癌一般分為4種主要的組織學類型：鱗癌、腺癌、大細胞癌和小細胞癌，前三者統稱為非小細胞肺癌(NSCLC)，約占肺癌總數的75％，后者稱小細胞肺癌(SCLC)，約占25％，肺癌的發生發展是一個多因素、多步驟的復雜過程，其中瘤基因和抑瘤基因發揮著至關重要的作用，已有研究顯示，肺癌在臨床前期就有大約10個分子事件，包括瘤基因myc、K-ras、EGFR、Her-2/neu、Bcl-2的激活與抑瘤基因p53、Rb、FHIT、p16的失活等，但這些基因在多種腫瘤中都普遍存在改變，還不足以完全解釋肺癌發生發展的機制，因此有必要繼續尋找和鑒定新的肺癌相關基因。

Girard等利用399個微衛星標記對肺癌細胞系及組織標本進行全基因組等位基因分析(allelotyping)，發現NSCLC中19p13區域存在高頻率的雜合性丟失(LOH)，已知定位于19p13.3的抑瘤基因LKB1/STK11，在約30％-50％有19p LOH的肺腺癌中失活，但定位于該區域的其他基因仍可能是肺癌的候選抑瘤基因，因為LKB1/STK11的突變目前只發現于肺腺癌中，而占NSCLC大多數的鱗癌中并未檢測到LKB1/STK11的突變。

BRGl是1993年Khavari等利用果蠅的Brm(Brahma)DNA片段為探針，篩選Hela細胞cDNA文庫而分離得到的一個人類基因，屬于進化上高度保守的SWI/SNF染色質重塑復合物的成員之一，它由35個外顯子和34個內含子組成，其轉錄本的大小約為5kh.BRG1蛋白由1613個氨基酸組成，共有4個結構域：I脯氨酸富集區、Ⅱ電荷富集區、Ⅲ依賴DNA的ATP酶區、IV溴化區，其相對分子質量為205kD，是一種磷酸化核蛋白，主要以ATP依賴的方式通過破壞組氨酸一DNA的接觸而調節基因的表達，通過放射雜交圖譜分析，已將BRGl定位于19p13，

大量研究表明：將BRGl重新導入到其缺陷的腫瘤細胞系中，可阻滯細胞生長并逆轉細胞的轉化表型；BRGl及SWI/SNF復合物的其他成員，能與Rb1、p53、BRCA1、LKB1/STK11等抑瘤基因產物相互作用，參與細胞生長和分化的調節，另外，轉基因動物實驗也證實：BRGl純合子突變(Brgl-/-)小鼠因不能發育而致死；BRGl雜合子突變(Brgl+/-)小鼠雖發育正常，但較BRGl野生型(Brgl+/+)小鼠容易發生腫瘤，這說明BRGl具有抑瘤基因的特征，可能與腫瘤的發生發展有關。

目前，國外關于肺癌中BRGl的研究較少，國內則未見報道，從已有的研究得知：BRG1蛋白在至少10％-30％的NSCLC組織和細胞系中表達下調或缺失，且這些BRGI蛋白表達缺失的NSCLC病例預后較差，但BRG1在我國肺癌患者中的表達情況及其mRNA和蛋白質表達的相關性仍不清楚，為此，我們從mRNA和蛋白質兩個水平對肺癌組織和細胞系進行BRG1表達分析，旨在闡明BRG1表達與肺癌發病的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞、組織與質粒

永生化人支氣管上皮細胞系HBE，肺鱗癌細胞系NCI.H520，肺腺癌細胞系A549，鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、HNE3、HONE1，大腸腺癌細胞系SW480、HT-29，宮頸癌細胞系HeLa，喉癌細胞系HEp-2，腎癌細胞系RLC和肝癌細胞系SMMC由本室提供，10例原發性肺癌組織標本，取自中南大學湘雅二醫院經病理確診且未經放療和化療的患者，其中肺鱗癌7例、腺癌2例、小細胞癌1例，29例肺癌及10例配對正常肺組織石蠟塊取自湘雅醫院病理科，包括肺鱗癌17例、腺癌5例、小細胞癌5例和腺鱗癌2例，質粒pBJ 5－BRGl由美國斯坦福大學Crabtree博士惠贈．

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶(大連寶生物工程公司)，限制性內切酶BamH I、Msp I、HpaⅡ(MBI公司)，逆轉錄試劑盒(Promega公司)，蛋白酶K、SDS(Sigma公司)，小牛血清、RPMI1640培基、TRIzol試劑、鮭精DNA、低熔點瓊脂糖(Invitrogen公司)，BCA蛋白質濃度測定試劑盒(PIERCE公司)，羊抗人BRGl抗體(Santa Cruze公司)，辣根過氧化物酶標記兔抗羊二抗、ECL Western blotting檢測試劑盒(Amersham Pharmacia公司)，dCTP(北京亞輝公司)，胰酶、λDNA/HindⅢ和PCR marker、瓊脂糖(華美生物工程公司)，PCR引物用Primer3軟件設計，由上海生工生物工程公司合成，PCR引物序列和產物大小見表1。

1.3 方法

1.3.1 RNA抽提及Northern雜交

細胞／組織RNA按TRIzol試劑操作程序提取。RNA電泳以及Northern雜交均參照文獻[14]的方法，探針標記則按試劑盒說明書進行，

1.3.2 RT-PCR

cDNA合成：取1μg RNA樣品，加1μLoligodT(0.5g/L)，65℃變性10min，冰上驟冷后加10×逆轉錄緩沖液2μL，25mmol/L MgCl4μL，10mmol/LdNTPs 2μL，RNasinO.5μL(40U/μL)，RNase-free水補至總體積20μL，42℃反應60min，95℃滅活5min，冰上驟冷，置-20℃冰箱保存。

PCR擴增：取逆轉錄產物2μL，置O.5 mLEppendorf管中，分別加入10×PCR緩沖液2μL，2mmol/L dNTPs 2μL，內對照上、下游引物各0.25μL(濃度12.5mmol/L)，BRGl cDNA上、下游引物各0.75IxL(濃度12.5mmol/L)，Taq酶lU。加亞沸水至終體積20μL，20μL石蠟油覆蓋，95℃預變性5min后，94℃變性30s，58℃退火50s，72℃延伸50s，共30個循環，最后72℃再延伸5min，產物于1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 Western印跡

蛋白質抽提：培養細胞用D－Hanks液洗滌兩遍，加裂解液(2％SDS，62.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/Lβ－巰基乙醇)50-100μL；振蕩混勻，冰上裂解30min；4℃ 12000r/min離心20min，吸取上清至新Eppendoff離心管中；吸少量用BCA法測定蛋白質濃度，其余加等體積2×Loading buffer(l35mmol/L Tris—HCl pH6.8，20％甘油，0.02％溴酚藍，6％SDS，10％β-巰基乙醇)沸水浴中加熱5min，-70℃保存待用．

Western blotting：每種細胞樣品取100μg蛋白質于8％SDS聚丙烯酰胺凝膠120V電泳2.5h；然后100V電轉移1h，使經分離的蛋白質轉移至硝酸纖維素(NC)濾膜，用PBS溶解的5％脫脂牛奶室溫封閉2h；羊抗人BRGl抗體1:100稀釋于5％脫脂牛奶中，與濾膜在室溫下于平緩搖動的搖床平臺上溫育1h；PBS洗膜3×15min，辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗l：2500稀釋于5％脫脂牛奶中，與濾膜在室溫下于平緩搖動的搖床平臺上溫育1h；PBS洗膜3×15min，保鮮膜上配制ECL檢測試劑(化學發光作用底物)，與濾膜作用3-5min；暗盒中曝光3min，取出X光片顯影、定影，取出濾膜，用麗春紅染色，顯示Loading對照．

1.3.4免疫組化S-P法和結果判斷及統計學分析

S-P法：石蠟切片常規脫蠟(二甲苯10 min×2次→無水乙醇5min×2次)→3％H₂O₂阻斷內源性過氧化物酶30min→95％酒精5min→85％酒精5min→自來水沖洗→雙蒸水洗5min×2次→10mmol/L EDTA液中高火檔微波修復抗原5rain×2次→I×PBS洗3min×2次→滴加封閉血清37℃30min→滴加一抗(BRGl抗體濃度為1：501 37℃→30 min后置4℃孵育過夜→PBS洗3min×3次→滴加二抗37℃30min→PBS洗3min×3次→滴加Streptadvidin-Peroxidase 37℃30min→PBS洗3 min×3次→DAB顯色1－2min→自來水沖洗→蘇木素復染脫水封片→光鏡觀察，陰性對照，用PBS液代替一抗，其余步驟同實驗組，陽性對照，用Hela細胞涂片做免疫組化。

判斷標準：BRGl蛋白主要表達于細胞核，因此陽性染色為棕黃色顆粒定位于細胞核內，光鏡下隨機觀察5個高倍視野共計500個細胞中的染色陽性細胞百分數，陽性細胞數<15％為BRGI表達陰性(-)；陽性細胞數>15％為BRGI表達陽性(+)；陽性細胞數>50％為BRGI表達強陽性(++)。

統計學分析：運用SPSS軟件包進行秩和檢驗。

2 實驗結果

2.1 RT-PCR檢測肺癌組織和腫瘤細胞系中BRGl的mRNA表達

以β-actin為內對照，應用RT-PCR方法檢測了15株腫瘤細胞系和10例肺癌組織中BRG1的mRNA表達．結果如圖1所示，BRGl在53.3％(8/15)被檢測的腫瘤細胞系中mRNA表達下調或缺失；10例肺癌組織中有6例BRGl的mRNA表達下調或缺失，而10例配對正常肺組織中均有BRGl的mRNA表達。

2.2 Northern雜交分析腫瘤細胞系中BRGl的轉錄情況

以GAPDH作為內對照，用Northern雜交證實BRG1在肺癌和鼻咽癌細胞系中的轉錄情況，結果如圖2所示，在A549、CNEI、HNE2和HNE3等4株細胞系中檢測不到BRGl的轉錄，而在另外4株細胞系即NCI-H520、CNE2、HNE1和HONE1中能檢測到BRG1的轉錄本，大小約5kb。

2.3 Western Blotting檢測腫瘤細胞系中BRGl蛋白的表達

以Hela細胞為陽性對照，進一步用WesternBlotting檢測肺癌和鼻咽癌細胞系中BRGl蛋白的表達情況．從圖3可見，A549、CNE1、HNE2和HNE3細胞中無BRGl蛋白表達信號，而HNE1、HONE1、CNE2和NC1-H520細胞中可檢測到BRGl蛋白的表達。

2.4 免疫組化分析BRGI蛋白在肺癌及配對正常肺組織中的表達

結果顯示：BRGI蛋白在配對正常肺組織中有較強表達，細胞核多呈棕褐色(見圖4A)，而BRGI蛋白在肺癌組織中表達程度明顯降低，細胞核多呈淡黃色或不著色(見圖4B)，

對BRGI蛋白在肺癌和配對正常肺組織中的表達水平進行統計分析(見表2)，利用SPSS軟件，采用秩和檢驗，結果顯示：BRGI蛋白在肺癌組織中的表達水平明顯低于配對正常肺組織，Z=-2.594。P=0.016(P＜0.05)，差異具有顯著性意義．

3 討論

肺癌在染色體19p13區域存在高頻率的LOH，通過放射雜交圖譜分析，BRGl已定位于19p13，根據Knudson的“二次打擊”學說，高頻率、非隨機的染色體LOH往往暗示該缺失區域中可能含有抑瘤基因，因而推測BRG1作為候選的抑瘤基因與肺癌的發生發展相關，另一方面，BRGl作為進化上高度保守的SWI/SNF染色質重塑復合物的成員之一，在哺乳動物細胞中可通過與Rb1、p53、BRCA1、LKB1/STK1，等抑瘤基因產物相互作用，參與細胞生長和分化的調節，同時，細胞轉染和轉基因動物實驗也證實BRGl具有抑癌基因的特征，

但迄今國外關于肺癌中BRGI的研究還較少，國內則未見報道，從已有的研究得知：BRGl蛋白在至少10％-30％的NSCLC組織和細胞系中表達下調或缺失，且這些BRGl蛋白表達缺失的NSCLC病例預后較差，不過這些資料均來自美國肺癌病人標本的研究，而BRGl在我國肺癌患者中的表達情況及其mRNA和蛋白質表達的相關性目前仍不清楚。

我們通過RT-PCR和Northern雜交，檢測到在60％(6/10例)的肺癌組織及肺腺癌細胞系A549等多種腫瘤細胞系中BRG，的mRNA表達下調或缺失．采用Western blotting方法則進一步證實，在BRGl轉錄下調的腫瘤細胞系中BRGl蛋白質的表達也下調或缺失，兩者間為正相關，對29例肺癌組織及10例配對正常肺組織標本進行免疫組化檢測，結果顯示BRG1蛋白在肺癌組織中表達的陽性率為37.9％(11/29例)，在配對正常肺組織中表達的陽性率為90％(9/10例)，經秩和檢驗分析，兩組間BRGl蛋白的表達水平具有顯著性差異(P＜O.05)，上述結果表明，BRG1確實在我國肺癌病人組織標本和多種腫瘤細胞系中表達異常，且其mRNA和蛋白質表達呈正相關，BRG1在肺癌中表達改變的原因值得進一步研究，這對于闡明BRG1在肺癌發病中的作用具有重要意義。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。