苧麻不同組織總ＲＮＡ的有效分離

摘 要：從植物組織中提取總RNA是進行植物分子生物學某些方面研究的必要前提，通過選用5種不同的試劑，我們找到一種新的RNAplant分離試劑，可以很有效的提取苧麻葉、莖皮、雌花、果的RNA，且質量很好，可以進行cDNA的合成和RT-PCR等下游實驗，并對不同試劑提取和多糖、多酚的去除進行了討論．

關鍵詞：苧麻：RNA；提取：

中圖分類號：Q331

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)01.0021.04

從植物組織中提取總RNA是進行植物分子生物學某些方面研究的必要前提，如進行Northom雜交分析，純化mRNA以用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分子生物學實驗，都需要高質量的總RNA，目前常用于植物材料RNA提取的方法有胍法、熱硼酸法，CTAB法、SDS法等，這些方法對于提取某些植物的總RNA是有效的，但對另外一些植物來說，卻并不一定是好的方法，因為不同植物組織的細胞內外成分復雜多變，在使用某些方法提取RNA時會起干擾作用，如LiC1沉淀，或造成RNA的降解、丟失，或得到的RNA樣品含雜質較多而干擾以后的分析研究工作，或者根本得不到RNA，原因是某些植物的組成成分和結構特點不同造成的，在結構上，一些植物具有更為堅硬的細胞壁，除了含有蛋白質、多糖等雜質外，同時含有更多的多酚化合物、木質素、纖維等物質，這些因素決定了這些植物組織RNA提取技術上的特殊性，

苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)是蕁麻目(Urticales)蕁麻科(Urticaceae)苧麻屬(Bochmeria)的多年生草本植物，起源于中國，苧麻主要以收獲纖維為目的來栽培，還可以用來造紙，做飼料，生產工業酒精，以及入藥等，苧麻含有大量的多糖，色素，酚類等物質，陳建榮使用Trizol試劑成功提取苧麻幼嫩莖段RNAt，程超華報道了CTAB法提取懸鈴葉苧麻花序RNA的方法，但是我們通過大量實驗，嘗試了幾種方法后，發現以上介紹的方法對苧麻組織的RNA提取時不是成本太高就是費時費力，本文使用一種新的RNAplant分離試劑，可以很有效的提取苧麻雌花、果實、葉片、莖皮的總RNA，且質量很好，可以進行mRNA的抽提、cDNA的合成、RT-PCR等下游實驗，而且性價比較好，省時省力節約成本。

1 材料和方法

1.1 植物材料

幼嫩的苧麻(Boehmeria nivea(L.)Gaudh)雌花、葉片、果實、莖皮都取自中國農業科學院麻類研究所“國家種質長沙苧麻圃”中地方品種的藤山雞骨白，在8月上旬-9月中旬取樣，每份材料都分裝于5mL凍存管后立即放于液氮中，后取出放于零下80℃冰箱儲存。

1.2 用具的處理與溶液的配制

所有用于RNA提取的用具的處理與溶液的配制均按文獻[14]要求進行.1)RNAplant抽提液購自天根生物有限公司(DP407-1，TIANGEN)；2)用DEPC處理的5mol/L NaCI；3)用DEPC水配置的75％酒精；4)用DEPC水配置的5mol/LKAc；5)新的無水乙醇；6)新的氯仿；7)新的異丙醇；8)Millipore 0.22 μm一次性過濾頭；9)DEPC水；10)一次性注射器。

1.3 總RNA提取步驟

1)在10 mL無RNase離心管中加入5 mL抽提液，稱取苧麻各部分材料各約0.5g，在液氮中迅速充分地研磨成粉末狀，收集進10mL離心管中，迅速激烈振蕩5min，室溫平放5min，

2)在4℃10000r/min離心5min．

3)取上清到新的10mL無RNase離心管，重復第2)步。

4)取上清到一次性注射器，用0.22μm一次性過濾頭過濾

5)測量過濾所得的上清體積，加入0.2倍體積5mol/L NaCl，混勻

6)加入0.6倍體積氯仿，上下顛倒混勻，

7)4℃10000r/min離心30min，取上層水相到新的無RNase離心管。

8)加入0.9倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。 9)4℃10000r/min離心30min，棄掉上清，注意不要倒出沉淀，加入5～10mL 75％乙醇，

10)4℃10000r/min離心5min，小心倒出液體，注意不要倒出沉淀，剩余少量液體可再次離心收集，然后用槍頭吸出棄掉。

11)加入70μL無RNase水，吹打幾次溶解RNA，－70℃保存。

1.4 RNA質量分析

取4μL RNA溶液用無RNase水稀釋100倍后，使用UNICAM Heλios-α型核酸蛋白儀進行A₂₆₀和A₂₅₀的測定，以A₂₆₀計算RNA的濃度(當A260=1時相當于40mg/L的RNA)，以A₂₆₀/A₂₈₀的比值評估RNA的純度。

1.5 RNA的瓊脂糖電泳檢測

取5μL所得的RNA，加1μL6×loadingbuffer后于1.2％的瓊脂糖膠上電泳，電壓為6V/cm，電泳15－20min后，凝膠成像儀照相分析(最好是變性膠)。

1.6 RT-PCR分析

用Oligo(dT)₁₈為引物在TIANGEN公司的M-MLV Reserse Transcriptase的作用下合成第一鏈cDNA，對苧麻不同部位材料合成的cDNA利用NCBI公布的苧麻ACTIN基因的mRNA序列，用Primer premier5.0軟件設計一對特異引物(P1：5－GCTCCGTFGAACCCTAAG-3’和P2：5’－GCTCCGATFGTGATGATTT-3’)進行PCR實驗，理論擴增片段420bp，反應程序是94℃2min；94℃45s，55℃45s，72℃45s(30個循環)；72℃5min結束PCR。

2 結果分析

2.1 4種苧麻組織RNA的紫外吸收測定結果(見表1)

從提取的4個不同組織的紫外吸收值看，利用RNAplant提取的苧麻4個組織得的RNA都達到了分子生物學實驗的要求，蛋白和多糖等污染較少，可以進行下游實驗，而且對于不同的組織所提的質量和數量略有不同，每克材料以葉片得到的RNA量最多也最好，其次是莖皮，然后才是雌花和果實，這是因為在雌花和果實中多糖和酚的含量大大增加的緣故。

2.2 RNA的瓊脂糖電泳檢測

圖1是使用RNAplant提取的苧麻葉片、莖皮、雌花和果實的RNA非甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結果．從圖1可以看出RNA都完整，可見3條主帶，相對分子質量較大的為28SrRNA，相對分子質量較小的為18SrRNA，最小的是5.8SrRNA，其余彌散者為wRNA，其中28S條帶的亮度與18S條帶的亮度之比接近2:1.說明提取的RNA完整性好無降解。

2.3 RT-PCR分析

使用RNAplant提取的苧麻花、果、葉、莖皮的RNA經過反轉錄合成cDNA后，利用苧麻ACTIN基因的特異引物進行PCR擴增，可以得到預期大小的片段，說明我們提取的RNA可以很好的合成cDNA及其他基于mRNA的實驗(圖2)。

3 討論

陳建榮、程超華都報道了提取苧麻RNA的方法，但是對于植物組織來說，不同的部位提取方法都有所改變，我們也嘗試使用了Invitrogen公司的Plant RNA Isolation Reagent和TRIzol以及天根公司的RNAprep Plant KIT和Omega公司的E.Z.N.A Plant RNA kit試劑來提取苧麻果實和葉片的RNA(見圖3)，對于葉片組織除TRIzol外都能提出符合要求的RNA，而苧麻的果實組織的RNA分離比較困難，只有Plant RNA IsolationReagent和RNAplant試劑可以提出，說明這兩種試劑對苧麻不同組織的RNA都能有效分離，但是Plant RNA Isolation Reagent的成本是RNAplant的3倍，綜合考慮我們選用RNAplant(TIANGEN)。

提取植物RNA時，多酚、多糖等次生物質干擾很大，酚可以和RNA不可逆結合而多糖在水中的理化性質與核酸相似，尤其與RNA相似，故不易被除去且多糖可以限制酶反應，本研究對該方法操作過程中的一些不足，作了一些改進．首先在選用植物組織抽提液時，考慮到對以后逆轉錄和體外翻譯等工作的影響，盡可能減少其他試劑的使用，同時本試劑含有β-巰基乙醇可以抑制內源和外源RNAase的活性；其次避免使用Li-Cl選擇沉淀RNA的步驟，防止了LiCl的殘留對以后工作所造成的不便；第三就是我們在實驗中發現在使用化學手段去除多糖的同時在輔助以物理的方法效果更好，雖然5mol/L NaCl可以去除多糖，但是本實驗中我們使用了0.22μm的過濾器后可以非常方便的得到質量很高的RNA(如果不使用過濾器那么就應該多抽提幾次，必要時要用酚／氯仿／異戊醇抽提，但是RNA的損失也教大，但是使用過濾器后RNA的得率也不高，差不多是100－150μg/g)，另外我們也嘗試使用5nol/L KAc和無水乙醇來去除多糖，在加入NaCl之前加入20％的無水乙醇和0.11倍的5mol/L KAc，室溫下放置15min后，4℃10000r/min離心30min，即可有效的去除多糖。

在RNA提取過程中常常得不到RNA或RNA產量很低，可能有兩方面的原因：一是核蛋白與核酸未能有效分離；二是核酸未能充分溶解到提取液中，離心時與雜質一同沉淀丟失，因此，筆者認為這些方法本身并沒有問題，關鍵在于操作手法的改進，根據筆者的經驗，在提取苧麻花RNA時，材料在提取液中必須經過強烈的震蕩才能提取出RNA。

RNA提取方法要求RNA沒有降解的同時還應有較高的產量，特別是mRNA不能在提取過程中丟失或降解，這是進行基因克隆之前提，不同植物及植物的不同部位其在自身的結構和組成上各不相同，如有的組織木質化程度高，有的細胞壁較厚，有的含某類物質多，有的易于降解等，因此很難用一種方法來適應所有的植物組織，所以，實驗人員不能用一套固定的操作去提取不同物種、不同組織的RNA，而應該在熟悉RNA提取基本原理及要點的情況下，根據實驗要求對實驗方法進行靈活地改進與組合，每一套方法都有自身的優缺點，只要掌握了它們的要點與基本原理，就可以對其進行有效地改進，適應各種實驗要求。

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