嗜酸乳桿菌表層蛋白提取方法及影響因素的研究

摘 要：對嗜酸乳桿菌S層蛋白的提取方法進行了改進，用酸性5mol/L LiC1法，中性5mol/L LiC4法和8mol/L尿素法提取嗜酸乳桿菌的表層蛋白，考馬斯亮蘭法測蛋白濃度，進行常規SDS－PAGE，用Gel－Pro軟件進行數據分析，得出其中酸性5mol/LiC1法提取表層蛋白百分含量最多，分析影響提取條件的因素，設置0、4、室溫(25℃)3個溫度梯度和10、15、20、25、30min 5個時間梯度，進行常規SDS－PAGE，檢測提取表層蛋白的效果，Sephadex G—100柱分離中性5mol/L LiC1法和8mol/L尿素法提取嗜酸乳桿菌的表層蛋白獲得S_[A]蛋白，酸性5mol/L LiC1法可用于分析各種表層蛋白；中性5mol/L LiC1法和8mol/L尿素法用于提取43kD_a的S_A蛋白，25℃處理15min得到最大量的表層蛋白。

關鍵詞：嗜酸乳桿菌；S層蛋白；酸性5mol/L LiC1法；中性5mol/L LiC1法；8mol/L尿素法

中圖分類號：Q939

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)01-0044-04

黏附作為益生菌在腸道上定植并發揮益生作用的第一步至關重要，目前，對益生菌黏附作用的機理的研究集中在益生菌表層蛋白(S層蛋白)與粘液蛋白的相互作用上，益生菌表層蛋白的提取方法紛繁多樣，嗜酸乳桿菌S層蛋白與細胞壁作用鍵是非共價鍵或離子鍵，故可利用疏水鍵破壞劑或電荷捕獲劑來提取，早在1979年，Ma－suda K等用高濃度的尿素提取乳桿菌(Lactobacillus brevis)表層蛋白；1980年．MasudaK又嘗試了鹽酸胍法提取乳桿菌(lactobacillusbrevis)表層蛋白；2004年，Garrote G L使用了高濃度的LiCl提取乳桿菌(Lactobacillus kefir和Lactobacillus parakefir)的表層蛋白獲得了較好的效果，由于乳酸菌表面的結構特征有較大差異，所以提取方法也有所不同。

嗜酸乳桿菌作為哺乳動物及人腸道內的主要益生菌群，無論是在保健行業還是在醫藥行業都有著不可忽視的地位，Egbert Smih等在2000年報道了嗜酸乳桿菌ATCC 4356表層蛋白中S_A蛋白的表達，并探討了相關基因的表達，國內的相關報道較少，本實驗對提取表層蛋白的方法與其影響因素進行了研究，找出適于對嗜酸乳桿菌S_A蛋白進行提取純化進而分析的優化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜酸乳桿菌(L actobacill us acidophil usATCC4356)購于中國農業微生物菌種保藏中心，凍干管菌種。

1.1.2 MRS液體培養基

蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，檸檬酸二銨2g，吐溫80mL，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·4H₂O 0.2g，K₂HPO₄ 2g，水1000 mL，121℃，1×10⁵ Pa滅菌20min.

1.2 方法

1.2.1 表面蛋白的不同提取方法

1)酸性5mol/L LiC1法

參考1997年Mark等提取表面蛋白的方法并進行改動，過夜厭氧培養物加入到35mL MRS液體培養基中37℃下靜置培養，至OD₆₀₀達到1.0時，6000r/min離心10min收集菌體，上述菌體用PBS洗滌兩次，加入0.5mL酸性5mol/LLiC1(pH2.0)，于冰水混合液中作用15min后，10000r/min離心10min收集上清，上清在4℃下對PBS充分透析，然后用PEG在4℃下濃縮后凍存備用。

2)中性5mol/L LiC1法

參考Takahiro等于1995年提取表面蛋白的方法并進行改動，菌體培養及收集同1中操作，收集的菌體(35mL OD₆₀₀達到1.0的菌液)凍干，每0.1g凍干菌體加入20mL 5mol/L中性LiC1溶液，在37℃振搖3h，4℃下10000r/min離心10min收集上清，上清對PBS充分透析后，4℃下用PEG進行濃縮后凍存備用。

3)8mol/L尿素法

參考Boot等1993年提取表層蛋白的方法并進行改動菌體培養、收集同1中操作，收集的菌體(35mL OD₆₀₀達到1.0的菌液)凍干，每0.1g凍干菌體加入20mL 8mol/L尿素溶液后，37℃振搖1h，10000r/min離心10min收集上清，上清對PBS充分透析后，4℃下用PEG進行濃縮后凍存備用。

1.2.2 總蛋白濃度的測定

考馬斯亮藍法測定3種方法所得總蛋白的濃度(具體操作按試劑盒說明進行)。

1.2.3 表面蛋白質的SDS-PAGE

將濃縮后(濃縮相同倍數)的表面蛋白加入2×樣品處理液煮沸10min，上樣10μL進行常規SDS-PAGE(相對分子質量marker上樣量為10μL)，分離膠濃度為12.5％，電泳條件為濃縮膠60V，分離膠80V，電泳完畢后對聚丙烯酰胺凝膠進行考馬斯亮蘭法染色，對比3種提取方法的異同。

1.2.4 處理時間對酸性5mol/L LiC1法所得表層蛋白濃度的影響

0℃時，菌體經酸性5mol/L LiC1處理不同時間段(10、15、20、25、30min)后，上樣10μL進行常規SDS-PAG(相對分子質量marker上樣量為10μL)，電泳條件同1.2.3，電泳完畢后對聚丙烯酰胺凝膠進行考馬斯亮蘭法染色，比較時間對表層蛋白濃度的影響。

1.2.5 溫度對酸性5mol/L LiC1法所得表層蛋白濃度的影響

在不同的溫度下(0、4、25℃)，用酸性5mol/L LiC1處理菌體15min后，上樣10μL進行常規SDS-PAGE(相對分子質量marker上樣量為10μL)，電泳條件同1.2.3，電泳完畢后對聚丙烯酰胺凝膠進行考馬斯亮蘭法染色，比較溫度對表層蛋白濃度的影響。

1.2.6 Gel-Pro軟件分析

2 結果與討論

2.1 3種方法的所得蛋白濃度和方法的比較

圖1顯示出酸性5mol/L LiCI法，中性5mol/L LiC1法。8mol/L尿素法3種方法提取的嗜酸乳桿菌表層蛋白的SDS-PAGE結果。

用考馬斯亮蘭法測蛋白總濃度，酸性5mol/L LiC1法所得表層蛋白濃度高于其它兩種方法，平均濃度為0.9g/L，中性5mol/L LiC1法所得表層蛋白平均濃度為0.7g/L，尿素法所得表層蛋白平均濃度為0.55g/L。

凝膠圖經Gel－Pro軟件處理，分析S_A蛋白的相對含量，其中2>3>4，即酸性5mol/L LiC1法提取的表層蛋白43 kDa的蛋白條帶濃度最高，最大OD值為0.11588，是中性5mol/L LiC1法(0.06057)的1.9倍，是8mol/L尿素法(0.05122)的2.26倍，但是3和4道的條帶單一，只有S_A蛋白，故提取S_A蛋白宜用中性5mol/L LiC1法或8mol/L尿素法要對表層蛋白的各種成分進行分析宜用酸性5mol/L LiC1法。

2.2 處理時間對表層蛋白提取的影響

分別用酸性5mol/L LiC1處理菌體蛋白10、15、20、25、30min后進行常規SDS-PAGE，結果見圖2。

凝膠圖經Gel-Pro軟件處理，1－6道S_A蛋白條帶的量分別為：120、88.1、94.4、93.7、205．2、63.4μg，其中，15min是這種方法的最優處理時間，所得43 kDa的蛋白條帶含量最高，明顯高于其它處理時間，酸性5mol/L LiC1對嗜酸乳桿菌表層的處理效果具有上弧線的曲線特點，隨著時間的延長，從菌體表層處理下越來越多的S層蛋白，達到一個最高值(15min)后，20min時的小相對分子質量條帶增多，推測原因是存在蛋白降解；大相對分子質量蛋白的增加，可能是短時間未被LiC1從菌體表層解離下來的相對分子質量較大的蛋白被解離下來造成的，時尖的最高值就是所得S_A蛋白條帶濃度最大時的處理時間。即15min，

2.3 溫度對表層蛋白提取的影響

選取3個不同的溫度，從PAGE的結果可看出室溫作用15min表層蛋白的提取影響不大，且利于LiC1的作用效果，條帶清晰，濃度高于0℃和4℃，故是最佳的處理溫度為室溫(25℃)，凝膠圖經Gel－Pro軟件處理，1－4道43kDa的蛋白條帶的量分別為120、47.4、66.2、90.8μg，很明顯地，室溫處理效果是最佳的。

嗜酸乳桿菌表層蛋白主要有兩個表達蛋白S_A和S_B，通常生理狀態主要表達S_A.S_A是將菌體黏附于腸道的主要黏附蛋白，其C端大約123個氨基酸深入到菌體細胞壁，而N端暴露在菌體外通過非共價鍵黏附在腸道表層，對表層蛋白的提取的研究有利于進一步研究表層蛋白與腸道粘液蛋白的相互作用，進而研究菌體定植于腸道的機理，利于研制益生菌類產品，造福人類。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。