甾醇生物合成中的關(guān)鍵酶—環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶的分子生物學研究

摘 要：植物體中環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶催化2，3－環(huán)氧角鯊烯形成一系列三萜烯，為甾醇和三萜化合物的生物合成提供前體，這一催化反應被認為是甾醇和三萜化合物生物合成分支形成的關(guān)鍵位點，綜述了甾醇和三萜化合物生物合成中的關(guān)鍵酶——環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶(OSCs)家族的生物學功能，基因克隆與屬性，酶的細胞定位與酶活的表達調(diào)控等分子生物學研究進展。

關(guān)鍵詞：環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶(OSCs)；甾醇；三萜化合物

中圖分類號：Q946．5

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)01—0010-06

植物體中許多次生代謝物產(chǎn)生于乙酸、莽草酸及甲羥戊酸等少數(shù)前體，在甲羥戊酸為前體的異戊二烯代謝途徑中，又分別以異戊烯焦磷酸、牻牛兒苗基焦磷酸、法尼基焦磷酸、牻牛兒苗、牻牛兒苗基焦磷酸為底物，形成一系列次級代謝分支，兩個法尼基焦磷酸縮合形成的三萜角鯊烯被轉(zhuǎn)化成2，3環(huán)氧角鯊烯(os)，接下來進行的2，3環(huán)氧角鯊烯(OS)環(huán)化是三萜化合物和甾醇生物合成的關(guān)鍵性第一步反應，所以，在此形成的甾醇(類固醇)生成支路和五環(huán)三萜(烯)生成支路成為基礎(chǔ)代謝和次生代謝的分支點(圖1)。

催化2，3環(huán)氧角鯊烯環(huán)化形成一系列中間產(chǎn)物的酶，在酶促生物化學研究和酶工業(yè)生產(chǎn)上都有重要意義，真核生物中，2，3氧化角鯊烯被環(huán)化形成兩種不同的三萜化合物：非光合生物中(脊椎動物、真菌)由羊毛固醇合成酶(LS)催化形成羊毛固醇，光合生物中則由環(huán)阿屯醇合成酶(CS)催化形成環(huán)阿屯醇，兩者都是甾醇的合成前體．另外，2，3氧化角鯊烯(OS)在高等植物中還可以環(huán)化形成其他結(jié)構(gòu)、功能各異的三萜化合物：齊墩果烷、烏斯烷、羽扇豆烷、達瑪烷、木栓烷(friedelane)等，在OSCs分離、純化，基因的克隆及表達分析上取得的新進展，使人們對酶結(jié)構(gòu)與2，3氧化角鯊烯環(huán)化機理有了更深入的了解。

1 環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶(OSCs)家族

1．1 甾醇生物合成中的OSCs

甾醇生物合成的前體羊毛固醇和環(huán)阿屯醇的形成起始于環(huán)氧角鯊烯椅-船-椅-船構(gòu)象的排列，產(chǎn)生中間體C-20原甾醇陽離子，接著這一中間體進行骨架重組形成羊毛固醇框架或環(huán)阿屯醇框架(圖1)，上述環(huán)化反應分別由羊毛固醇合成酶(LS)和環(huán)阿屯醇合成酶(CS)催化完成。

通常純化足夠量的OSCs來進行氨基酸序列分析或生產(chǎn)抗體是很困難的，植物中環(huán)阿屯醇合成酶不僅量很少，而且很難獲得具有生物活性的溶解酶．另外，植物中環(huán)氧角鯊烯經(jīng)環(huán)化后能產(chǎn)生除環(huán)阿屯醇外一種或多種化合物，實驗中無法用粗勻漿液來作為單一酶活的研究，近年來，通過對環(huán)阿屯醇合成酶的克隆體進行異源表達為解決這一難題帶來了希望，但后來的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)阿屯醇在酵母中表達量很少，使得環(huán)阿屯醇合成酶基因很難通過互補突變體的方法進行克隆，而植物阿屯醇合成酶代謝突變體又不易獲得，一種解決辦法就是采用體外飼喂氚標記的氧化角鯊烯底物對酵母提取液中環(huán)阿屯醇酶活力進行檢測，另一種方法是用接有組成型酵母啟動子的植物cDNA文庫轉(zhuǎn)化突變體酵母(SMY1)，然后用TLC或HPLC分析環(huán)阿屯醇酶的活性，還可以通過合成類似物的方法來仔細研究它們的分子細節(jié)，哺乳動物和真菌中，羊毛甾醇合成酶較易獲得，動物肝臟和面包酵母勻漿物中都含有豐富的的羊毛甾醇合成酶，可以直接用于酶促反應，而且其中只含有一種變位酶，酶促反應中的產(chǎn)物也是唯一的，因此研究較為深入。

隨著人們對LS、CS酶序列了解的日益增多，發(fā)現(xiàn)這些氨基酸序列中存在極度保守的部分，酵母、人類、老鼠的羊毛固醇合成酶(LS)的cDNA序列就是根據(jù)這些保守序列設計簡并引物，通過PCR克隆出來的，亞麻(P.sativum)中環(huán)阿屯醇合成酶(CS)cDNA的克隆也是如此，cDNA的功能可以通過在LS－缺陷型酵母中來表達確定。

1．2 三萜生物合成中的OSCs

環(huán)氧角鯊烯通過椅-椅-椅-船式構(gòu)象變化，則形成四環(huán)素達瑪正離子中間體，在環(huán)氧角鯊烯達瑪二烯醇合成酶催化下，該正離子生成達瑪烷型三萜，四環(huán)素達瑪正離子還可進一步轉(zhuǎn)化形成羽扇豆正離子或齊墩果正離子，再由它們形成羽扇豆、β-香樹素和α-香樹素，之后被修飾成五環(huán)三萜，三萜合成酶怎樣催化形成不同產(chǎn)物的機制還不甚了解。

烏斯烷型三萜和齊墩果烷型三萜是兩種主要的三萜骨架形式，那么，β－香樹素和α－香樹素形成的機制就成為首要解決的問題，實際上，環(huán)化的差異主要出現(xiàn)在C-19oleanyl正離子階段，β－香樹素和α－香樹素合成酶活性位點的保守氨基酸殘基可能與C-19 oleanyl正離子形成有關(guān)，其中特異氨基酸殘基可能決定該正離子的轉(zhuǎn)移特征，β－香樹素和口，香樹素合成酶的克隆有助于對這兩個分支途徑的理解。

2，3環(huán)氧角鯊烯環(huán)化形成不同的三萜化合物是由單一或不同的環(huán)化酶作用產(chǎn)生，還是環(huán)化作用之后一些因子修飾而成?豌豆幼苗葉中β－香樹素合成酶和環(huán)阿屯醇合成酶的活性變化與固醇和三萜化合物含量的變化一致，說明這兩種酶是不同的蛋白，隨著人參、豌豆、橄欖、蒲公英、擬南芥等雙子葉植物的β－香樹素合成酶、羽扇豆合成酶和其它一些多功能三萜合成酶基因的克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)三萜合成酶在結(jié)構(gòu)上與其它的環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶具有相似性，應屬環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶家族中的獨立分支，由2，3－環(huán)氧角鯊烯環(huán)化可產(chǎn)生90多種不同碳架的三萜化合物，而目前只發(fā)現(xiàn)三類三萜合成酶：β－香樹素合成酶、羽扇豆醇合成酶、混合型香樹素合成酶，自然界是否也存在相應數(shù)量的三萜合成酶或者是否存在多功能酶已為許多研究者所關(guān)注。

2 環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶(OSCs)基因克隆

一系列物種的羊毛固醇合成酶(哺乳動物、酵母等)、環(huán)阿屯醇合成酶(擬南芥、人參、水稻、豌豆、甘草等)、三種三萜合成酶、兩種βAS和一種羽扇豆醇合成酶的cDNA已經(jīng)報導，基因序列分析表明，在植物環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶中，三萜合成酶和環(huán)阿屯醇合成酶應屬環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶家族中的獨立分支，Tania Husselstein-Muller等對擬南芥三萜合成酶基因結(jié)構(gòu)采用“GTX XAG規(guī)則”手工分割內(nèi)含子，結(jié)果獲得了1種環(huán)阿屯醇合成酶(ATCYC)，5種羽扇豆醇合成酶(ATLUP1-5)，和7種5環(huán)三萜合成酶(ATPEN1-7)，其中環(huán)阿屯醇合成酶基因包含18個外顯子，羽扇豆醇合成酶(ATLUP1，2)有17個外顯子，五環(huán)三萜合成酶(ATPEN1，2)含外顯子14個，其它3種羽扇豆醇合成酶(ATLUP3-5)和另外5種環(huán)三萜合成酶(ATPEN3－7)也呈現(xiàn)出非常相似的結(jié)構(gòu)，不同的亞族成員其外顯子數(shù)量變化不大，外顯子與內(nèi)含子之間間隔相似，但內(nèi)含子數(shù)量變化較大，剪接方式在亞族內(nèi)高度保守，在整個OSCs基因家族中也很保守。

氨基酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，環(huán)阿屯醇合成酶類氨基酸序列的相似性達到80％，三萜合成酶類具有70％的相似性，與環(huán)阿屯醇合成酶間的相似性也達到60％，所有OSCs酶的氨基酸序列中都存在DCTAE和QW高度保守區(qū)域。

有些三萜合成酶是高度特異性的，如人參盧一香樹素合成酶(βAS)和豌豆羽扇豆合成酶(LUS)，而有些則是多功能的，如PSM(豌豆)和IUP1(擬南芥)，PSM的催化產(chǎn)物中β－，香樹素和α－香樹素的量幾乎相等，LUP1催化產(chǎn)物中羽扇豆醇占了絕大部分，β－，香樹素只占了少量，另一豌豆β－，香樹素合成酶PSY的氨基酸序列與PSM具有78％的同源性，但催化產(chǎn)物卻截然不同，β－香樹素是PSY催化產(chǎn)生的唯一產(chǎn)物，將PSM的氨基酸序列與已知的3種β－香樹素合成酶序列比較發(fā)現(xiàn)，PSM中的一些氨基酸序列沒有其他3個酶對應部位那樣保守，如Leu257被Trp替換，Gln代替Met285，Thr代替Val331，Arg代替His337，而這些部位已被證實與產(chǎn)物類型分化有關(guān)，是否由于脂肪族Leu代替芳香族Trp后導致C₁₉的π正離子不穩(wěn)定，而更有利于在C₂₀處產(chǎn)生更穩(wěn)定的三級正離子，導致α-香樹素的生成，這還有待點突變試驗的進一步證實，擬南芥ATLUP2也是一種多功能蛋白，可以催化合成β-香樹素和α-香樹素(85％)和羽扇豆醇(15％)三種產(chǎn)物，實驗表明由人參β-香樹素合成酶cDNA的N末端和羽扇豆醇合成酶cDNA的C末端構(gòu)成嵌合體在酵母中表達，產(chǎn)物中出現(xiàn)β-香樹素和羽扇豆醇(3：1)兩種三萜，這種一酶多產(chǎn)物現(xiàn)象說明環(huán)化過程中有些步驟酶控不嚴謹，

3 環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶(OSCs)基因的表達調(diào)控

運用OSCs的不可逆抑制劑和OSCs突變分析發(fā)現(xiàn)，高度保守序列DCTAE與底物結(jié)合有關(guān)，將SCs的DDTAV定點突變成DCTAE，結(jié)果導致該酶底物由角鯊烯變成2，3－環(huán)氧角鯊烯，IkureAbe and Glenn D.Prestwich(1994)用CNBr降解3H29-MOS標記的小鼠肝OSCs獲得一段6 kD高度保守的放射性肽段，該肽段含30個氨基酸，處在蛋白質(zhì)的C末端，與先前報導的SCs中的活性位點高度同源，為Asp-Asp-Thr-Ala-Glu-Ala，不可逆抑制劑共價結(jié)合的位點是兩個Asp-Asp殘基，抑制劑³H₂₉-MOS可以環(huán)化形成21-甲基原甾醇正離子，這個三級烯丙正離子接著被兩個相連的Asp親核攻擊，形成酯鍵造成酶失活，相似的實驗也證實了SCs(Alicyclobucillus acidoculdurius)氨基酸序列中的兩個Asp殘基(DDTAV中376，377位點)對于酶的活化是致關(guān)重要的，這些殘基分布在酶二聚體的大中心腔內(nèi)，酵母和植物的OSCs不能被³H₂₉-MOS標記，可能酶中的親核氨基酸丟失或酶催化過程中沒有出現(xiàn)烯丙正離子中間體。

Ikuro Abe等(2001)將c.caerulens OSLC的N末端第二個M₅₀作為起始密碼子，造成酶結(jié)構(gòu)和活性部位的變化研究其催化產(chǎn)物的變化情況。為此，他們構(gòu)建了一個截短的重組酶，起始于第二個M，使之在酵母GIL77中表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于N末端的缺失導致酶活的完全喪失，轉(zhuǎn)化細胞的勻漿液抽提物中檢測不到環(huán)化產(chǎn)物，表明N末端的30個親水氨基酸殘基對于C.caerulens OSLC的酶活是至關(guān)重要的。

保守區(qū)段DCTAEA中負電性的D₄₅₆被認為是穩(wěn)定初始化C-20原甾醇正離子的調(diào)控位點，Cory等(1996)曾經(jīng)報導該殘基是環(huán)氧己烷親電活化的質(zhì)子供體，另外，H₂₃₄被認為是底物結(jié)合位點，在維持正離子穩(wěn)定方面起作用，對S.cerevisiae中OSLC的H₂₃₄進行點突變研究發(fā)現(xiàn)，H₂₃₄被F替代，或H₂₃₄A、H₂₃₄K、H₂₃₄R、D₄₅₆N突變體均失去活性，C.caerulens OSLC中D₄₅₆和H₂₃₄氨基酸殘基對酶的作用與上述情況基本相同，只是H₂₃₄W和H₂₃₄K具有少量酶活(5％)，活性位點H₂₃₄殘基的咪唑環(huán)可被部分替代，而H₂₃₄F突變表現(xiàn)失活，表明該酶存在物種差異性。

除了氨基酸序列中的DCTAE／DDTAV保守序列外，OSCs和SCs氨基酸序列中還出現(xiàn)了4－8次重復的芳香族氨基酸區(qū)域(QW)，研究表明，這些重復序列可能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能相關(guān)，QW區(qū)域是負電性的，可能在環(huán)化過程中與中間正離子相互作用²⁰。

OSCs被認為是引導異戊二烯代謝途徑流向甾醇和三萜化合物形成的關(guān)鍵所在，那么對這些酶進行調(diào)控就可控制代謝流向¹⁹，2，3－環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶抑制劑研究的比較多²²。

4 環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶的空間結(jié)構(gòu)及細胞定位

目前還沒有研究確定OSCs的二維、三維空間結(jié)構(gòu)，角鯊烯何帕烷環(huán)化酶(SHCs)已有這方面的報導，SHCs參與角鯊烯環(huán)化產(chǎn)生五環(huán)三萜化合物何帕烯，這是原核生物膜中的一個重要組成，細菌中一些SHCs基因已被克隆，OSCs和SHCs的氨基酸序列具有相關(guān)性，它們的空間結(jié)構(gòu)可能有相似的地方，革蘭式陽性菌AlicyclobuciUus aci－doculdurius的SHCs重建晶體結(jié)構(gòu)是一個二聚體，每個亞基包含兩個a螺旋結(jié)構(gòu)域，由此構(gòu)成一個疏水中心。

酵母OSCs亞細胞定位研究起始于30年前，Shechter比較了酵母和哺乳動物OSCs的屬性，認為酵母中的酶是可溶的，而哺乳動物的酶連接在微粒上，但是可溶性酵母OSCs的屬性又和真正意義上的水溶性胞質(zhì)酶不盡相同，這些結(jié)果表明酵母OSCs可能是部分結(jié)合的，只在細胞瓦解和勻漿碎片中變得可溶，從OSCs的氨基酸序列上看，它們不具備信號序列和明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，而保留了膜結(jié)合的其他變化形式，與這一推論相符的是，SC(來自A.acidocaidarias)酶表面是一個非極性表面，適于插入膜中心，Paola Milla等(2002)通過酶活分析、Western blot及體內(nèi)Erg7p—GFP(酵母羊毛固醇合成酶)熒光標記實驗證明Erg7p幾乎完全連接在脂肪顆粒上，其它組織包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶的量很少，在Erg7p突變體和野生型細胞培養(yǎng)中加入酶的抑制劑，發(fā)現(xiàn)Erg7p的底物，環(huán)氧角鯊烯大多集中在脂肪顆粒中，他們認為脂肪顆粒不僅是營養(yǎng)脂肪儲存位點，還參與甾醇的代謝、運輸?shù)取?/p>

5 展望

基因分析得到的OSCs大小約85kD，然而經(jīng)分離純化后所的蛋白質(zhì)實際分子質(zhì)量要小，比如豌豆中的CS：55kD，βAS：35kD；R.Japonica中的CS：54kD，βAS：26kD，酵母LS：26kD，Nonhernblot分析證實OSCs基因表達序列長度為2-3kb，符合cDNA完全長度范圍，造成這種差異的原因是什么，在豌豆中，β－香樹素的含量在種子萌發(fā)階段較高，而甾醇的含量要在萌發(fā)之后幾天才會增加，類似的報道在單子葉植物高粱也有，這種甾醇和三萜含量變化的生物學意義仍不清楚，羊毛固醇合成酶(LS)在抗生素及膽固醇類藥物研究開發(fā)中已經(jīng)受到重視，同樣，為實現(xiàn)對甾醇生物信號分子和具有植保、特異性藥物功能的三萜化合物合成的人工調(diào)節(jié)，加強對植物環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶(OSCs)種類、酶催化與產(chǎn)物特異性關(guān)系研究具有重要的生物學意義。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。