ＳＫＦ－９６３６５對ＳＤ大鼠急性分離下丘腦神經(jīng)元溫度敏感性的影響

摘 要：采用電流鉗技術(shù)觀察SD大鼠急性分離下丘腦神經(jīng)元的自發(fā)性放電及其溫度敏感特性，顯微鏡下，急性分離神經(jīng)元表現(xiàn)為兩種形態(tài)，一種具有突起，另一種表現(xiàn)為無突起的形態(tài)，記錄到的有突起的78例神經(jīng)元中，可以記錄到4例熱敏神經(jīng)元(wsn)，但在無突起的61例神經(jīng)元沒有觀察到熱敏神經(jīng)元的存在，在浴槽液體中加入SKF96365，這些熱敏神經(jīng)元就會失去溫度敏感性，以上結(jié)果表明pWSN可能通過突起部位上分布的TRPV₄而起到對周圍環(huán)境溫度的感受作用。

關(guān)鍵詞：熱敏神經(jīng)元：TRP；溫度

中圖分類號：Q42

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)01－0025－03

在外界環(huán)境溫度變化時，下丘腦神經(jīng)元通過調(diào)整放電率來維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，根據(jù)神經(jīng)元對外界環(huán)境刺激的放電反應將其區(qū)分為如體溫敏感和不敏感神經(jīng)元等類型，在溫度升高時放電率增加不低于0.8impulse/(s·℃)的神經(jīng)元稱為熱敏神經(jīng)元，但目前對下丘腦神經(jīng)元的溫度敏感機制尚不完全，文獻報道在皮膚和外周神經(jīng)元對溫度信號的感受過程中，TRP蛋白都起著關(guān)鍵的作用，溫度可以激活TRP通道，出現(xiàn)外向整流的電流成分，但TRP離子通道蛋白是否參與下丘腦視前區(qū)和下丘腦前部(POAH)的溫度感受功能，目前存在較多的爭論，甚至出現(xiàn)針鋒相對的爭論，Martin M等在研究中證實神經(jīng)元的纖維聯(lián)系網(wǎng)上有TRPV₄的存在，本文通過觀察采用TRPV通道的阻斷劑SKF-96365對溫度變化時急性分離的下丘腦神經(jīng)元放電率的影響，試圖揭示TRP通道是否參與熱敏神經(jīng)元的溫度敏感機制的形成。

1 材料和方法

1.1 下丘腦腦片制作和神經(jīng)元急性分離

取出生后(17±2)d的SD大鼠，快速斷頭去腦，分離出下丘腦，迅速置于0℃的高濃度蔗糖液中，用振動切片機 (World Precision InstrumentsMA752)切割成400μm厚的腦片，在HBSS(Sigma)液中漂洗3次后置于95％O₂和5％CO₂飽和的EBSS(Sigma)液中孵育1h，用針頭將腦片分離成小塊組織后放入32℃通100％O₂的含0.5-1.2g/L細菌蛋白酶XⅣ(Sigma)的HBSS溶液中進行消化，消化時間在10-30min內(nèi)，酶濃度和消化時間根據(jù)出生天數(shù)依據(jù)分離出神經(jīng)元的活性進行調(diào)整，漂洗后用不同管徑的Paster吸管吹打成細胞懸液，靜置待細胞貼壁。

1.2 電生理記錄

玻璃微電極拉制后尖端直徑為1－2 mm，充滿電極內(nèi)液后阻抗為4－5MΩ，浴槽液成分(mmol/L)為NaCl(125)、HEPES(10)、KCl(2.5)、MgCl₂(2)、CaCh₂((1)、D-glucose(10)(pH 7.2 with NaOH)，電極液成分(mmol/L)為K-asparate(120)、NaCl(20)、CaCh(2)、EGTA(O.2)、HEPES(10)(pH7.2 with KOH)，記錄在20－24℃的室溫下進行，實驗用CEZ2400膜片鉗放大器，當電極尖端與細胞膜之間形成大于1GΩ的高阻密封后，給以負壓破膜，使電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液相通后形成全細胞模式，采用電流鉗模式記錄靜息狀態(tài)下神經(jīng)元的自發(fā)性放電，電壓信號經(jīng)放大器放大后通過接口與計算機相連，經(jīng)1kHz濾波，結(jié)果分析等均借助計算機用pCLAMP 9.0軟件完成，

1.3 神經(jīng)元溫度敏感性的分析

神經(jīng)元溫度敏感性的觀察主要通過TC－202A雙向控溫浴槽(Harvard Apparatus，美國)來實現(xiàn)，安置在浴槽中的溫度反饋裝置可以調(diào)節(jié)溫度誤差在±0.2范圍內(nèi)，為確保神經(jīng)元放電的溫度依賴性，通常先記錄36－37℃下的自發(fā)性放電3－5min，然后溫度在33－39℃之間改變，每個溫度下持續(xù)的時間不低于2min，根據(jù)文獻報道，以神經(jīng)元的放電率作為縱軸，溫度(最小不低于3℃)為橫軸繪制曲線，以曲線的回歸系數(shù)定義神經(jīng)元的溫度敏感性(impulse/(s·℃))，熱敏神經(jīng)元(WSN：Warm-sensitive neurons)的溫度敏感性至少高于+0.8impulse/(s·qC).

1.4 數(shù)據(jù)記錄和分析

數(shù)據(jù)以表示，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0軟件包處理分析，統(tǒng)計方法采用ANOVA法，P＜O.05為存在顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 急性分離的下丘腦神經(jīng)元與自發(fā)性放電的記錄

在(×40)顯微鏡下，急性分離下丘腦神經(jīng)元表現(xiàn)為兩種形態(tài)，一種由于在分離過程中的機械損傷和／或酶的消化，突起缺失，形態(tài)表現(xiàn)為圓或橢圓形狀；另一種神經(jīng)元存在突起，分支多呈現(xiàn)為單極或雙極形態(tài)，分別記錄兩類神經(jīng)元的自發(fā)性放電，無突起神經(jīng)元自發(fā)性放電神經(jīng)元的比率占記錄神經(jīng)元的14.8％(n=61)，有突起神經(jīng)元則為15.4％(n=78)，x²檢驗顯示二者無明顯差別，

2.2 SKF-96365對WSN溫度敏感性的影響

當給存在自發(fā)性放電的急性分離下丘腦神經(jīng)元施加不同溫度(33－39℃)的時候，神經(jīng)元的放電頻率主要有兩種變化，一種神經(jīng)元放電頻率增高，另一種沒有明顯變化，本文主要觀察那些在溫度升高時放電頻率明顯增加、放電率≥+0.8impulse/(s·℃)的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元被定義為WSN，在我們記錄到的61例無突起神經(jīng)元中，沒有觀察到WSN的存在，存在自發(fā)性放電的神經(jīng)元的放電率介于0－0.45impulse/(s·℃)之間；而在有突起神經(jīng)元的78例神經(jīng)元中，我們觀察到4例WSN，當向這些神經(jīng)元的浴槽液里加入10μmol/L的SKF-96365時，神經(jīng)元的自發(fā)性放電會明顯降低，在30－31℃時，放電頻率降低7.1％，升高溫度至34-39℃，這些神經(jīng)元的放電頻率也不表現(xiàn)為明顯加快，放電率介于0-0.23impulse/(s·℃)之間(圖1)，這表明SKF96365可以使WSN失去溫度敏感性。

3 討論

關(guān)于短暫感受器電位TRP是否參與中樞神經(jīng)元溫度敏感性的形成機制一直存在較多的爭論，但TRP家族中參與溫度感受的TRP家族亞型已被證實參與外周的溫度信息感受傳導，這包括感受≥42℃的TRPV₁、感受≥52℃的TRPV₂通道、感受接近于33－39℃生理范圍的TRPV₃通道和能夠感受≥27℃的TRPV₄通道，但這些感受溫度的TRP離子通道是否參與下丘腦的溫度敏感機制尚無定論，有實驗證實在下丘腦的POAH部位主要存在TRPV4通道，為此本實驗在急性分離的基礎(chǔ)上通過采用TRP通道阻斷劑SKF-96365觀察了TRP是否參與大鼠下丘腦神經(jīng)元溫度敏感性的變化。

WSN分為初級WSN(pWSN)和次級WSN(sWSN)，pWSN溫度敏感性源于其自身具有溫度敏感離子通道的特性，因此在溫度變化時能夠始終保持定義中熱敏神經(jīng)元的特征，這種特征同樣在打斷突觸聯(lián)系后的游離神經(jīng)元中存在，因此在我們實驗記錄到的熱敏神經(jīng)元中，幾乎全部都屬于pWSN，本文結(jié)果顯示在存在突起具有自發(fā)性放電的78例神經(jīng)元中，可以記錄到4例pWSN，但在無突起的神經(jīng)元中，記錄不到pWSN的存在，這顯示了神經(jīng)元突起對于pWSN特性的重要性。

文獻報道TRPV4多存在于神經(jīng)纖維的部位，但在胞體部位較少觀察到，這就使我們有理由推測神經(jīng)元通過突起上分布的TRPV₄通道感受環(huán)境的溫度變化從而影響神經(jīng)元在溫度升高時的放電率，我們的實驗通過在浴槽中加入TRPV的通道阻斷劑SKF96365，結(jié)果表明pWSN失去了溫度敏感性，這一結(jié)果也表明pWSN可能通過突起部位上分布的TRPV₄而起到對周圍環(huán)境溫度的感受作用。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。