均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化建蘭ＩＳＳＲ－ＰＣＲ體系

摘 要：采用均勻設(shè)計(jì)，對(duì)影響建蘭ISSR—PCR體系的引物、Mg²⁺、dNTP和Taq DNA聚合酶濃度等進(jìn)行4因素5水平和4因素3水平兩輪優(yōu)化，建立了適合于建蘭ISSR-PCR的反應(yīng)體系：在20μL反應(yīng)體系中，含引物0.25tLmol/L、Mg²⁺2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA 40ng.在此基礎(chǔ)上對(duì)擴(kuò)增程序中的循環(huán)次數(shù)和退火溫度，以及ISSR引物進(jìn)行篩選，篩選獲得的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；接著進(jìn)行32個(gè)循環(huán)：94℃變性35s，52－56℃退火45s，72℃延伸90s；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min.同時(shí)篩選得到14個(gè)擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的ISSR引物。

關(guān)鍵詞：建蘭；ISSR—PCR；均勻設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)：Q949.662

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847(2007)01-0058-06

建蘭(Cymbidium ensifolium(Linn.)Sw.)為蘭科(Drchidaceae)蘭屬(Cymbidium)植物，極具觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，蘭科植物廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境，表現(xiàn)有高度特異的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理特性，建蘭也不例外，長(zhǎng)期的自然雜交以及人工選育，品種間存在很高的遺傳分化和種間類型，這為雜交育種選配親本提供了豐富的種質(zhì)資源；但同時(shí)，僅憑花色、花型、葉色、葉型、花梗等傳統(tǒng)的形態(tài)指標(biāo)來(lái)辯識(shí)品種，則存在很大難度，這不僅給品種的整理和研究帶來(lái)困難，同時(shí)也影響新品種的注冊(cè)登錄和產(chǎn)權(quán)保護(hù)。

以DNA指紋圖譜為指標(biāo)的分子標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記的位點(diǎn)數(shù)遠(yuǎn)大于形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記，且不易受環(huán)境因素的影響，可彌補(bǔ)或解決形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記中的缺陷或難題，因此，被廣泛用于植物品種的鑒定，ISSR(inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間)是Zietkiewicz等在SSR(simplesequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù))基礎(chǔ)上創(chuàng)建的，基于PCR技術(shù)的一種新型分子標(biāo)記，其基本原理是利用真核生物基因組中廣泛存在的SSR來(lái)設(shè)計(jì)引物，而無(wú)需預(yù)先克隆和測(cè)序，用于ISSR-PCR擴(kuò)增的引物通常為16－18個(gè)堿基序列，其主體是2－4個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列，然后在其5′端或3’端加上1－4個(gè)錨定堿基，引起特定位點(diǎn)退火，使引物與相匹配的SSR的一端結(jié)合，從而保證ISSR引物能夠?qū)SR之間的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ISSR分子標(biāo)記操作簡(jiǎn)單，可揭示的多態(tài)性較RAPD和RFLP、SSR高，重復(fù)性較RAPD好。成本較AFLP低，目前已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、生物進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究等，顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。

然而，ISSR分子標(biāo)記是基于PCR技術(shù)的，其反應(yīng)結(jié)果同樣受諸多因素的影響，因此在應(yīng)用IS-SR標(biāo)記技術(shù)時(shí)，需針對(duì)研究的物種，對(duì)ISSR-PCR體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的擴(kuò)增結(jié)果，確保標(biāo)記的可靠性，優(yōu)化IS-SR-PCR體系和擴(kuò)增程序，目前大多采用單因子試驗(yàn)法，即依經(jīng)驗(yàn)確定一個(gè)起始條件，然后依次調(diào)整某個(gè)因素，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近最佳，單因素試驗(yàn)忽略了因素間的綜合效應(yīng)，結(jié)果很難達(dá)到預(yù)期的最優(yōu)化，均勻設(shè)計(jì)是在正交設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種適用于多因素多水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，與正交設(shè)計(jì)對(duì)比，均勻設(shè)計(jì)只考慮試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)的均勻分散，而忽略了整齊對(duì)比，其特點(diǎn)是任何一個(gè)因素的諸個(gè)水平作相同數(shù)目的試驗(yàn)，因此，試驗(yàn)次數(shù)大大減少，本研究采用均勻設(shè)計(jì)，對(duì)影響ISSR-PCR的主要因素Mg²⁺、dNTP、引物以及Taq DNA聚合酶濃度等分別進(jìn)行5水平和3水平兩輪優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，獲得建蘭ISSR-PCR體系的優(yōu)化組合，并在此基礎(chǔ)上對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增程序中的退火溫度和反應(yīng)循環(huán)次數(shù)進(jìn)行比較篩選，旨在建立適合于建蘭的ISSR-PCR條件，進(jìn)一步為建蘭的品種鑒定、種質(zhì)資源保護(hù)和分子輔助育種等的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用建蘭樣本取自福建省龍巖市連城縣朋口鎮(zhèn)福建蘭花基地，用手術(shù)剪剪取建蘭嫩葉，蒸餾水沖洗干凈，涼干水分，稱0.2g于已滅菌的研缽中，加2mL SDS高鹽提取介質(zhì)和少量石英砂，迅速研磨，勻漿移至離心管，置冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，-18℃冰箱保存。

1.2 DNA提取和質(zhì)量檢測(cè)

建蘭DNA提取和質(zhì)量檢測(cè)按文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，

1.3 ISSR-PCR體系優(yōu)化

參考有關(guān)DNA模板濃度對(duì)ISSR-PCR體系的影響，發(fā)現(xiàn)ISSR-PCR對(duì)DNA模板濃度不甚敏感，在20μL反應(yīng)體系中20－60ng的模板均能有穩(wěn)定而清晰的擴(kuò)增，為此，本實(shí)驗(yàn)在20μL反應(yīng)體系中，將模板DNA設(shè)為定值40ng。

針對(duì)4個(gè)影響因子：MgM²⁺、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶濃度，采用兩輪均勻設(shè)計(jì)對(duì)建蘭ISSR-PCR體系進(jìn)行優(yōu)化。

首先，對(duì)4個(gè)影響因子，各設(shè)置5水平進(jìn)行考察(表1)，根據(jù)均勻設(shè)計(jì)表U₂₀(5⁴)安排第1輪實(shí)驗(yàn)(表2)。

對(duì)第1輪實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，初步篩選出優(yōu)化組合，并以此作為第2輪均勻設(shè)計(jì)的依據(jù)，第2輪均勻設(shè)計(jì)的因素和水平見(jiàn)表3，選擇均勻設(shè)計(jì)表U₁₂(3sup>3)安排實(shí)驗(yàn)(表4)。

以提取的建蘭DNA為模板，UBC836為引物，根據(jù)表2和表4分步制備總體積為20μL，內(nèi)含40ng模板DNA的ISSR-PCR體系，在Biometra T型Thermoeycler儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；接著進(jìn)行32個(gè)循環(huán)：94℃變性35s，56℃退火45s，72℃延伸90s；循環(huán)結(jié)束后，在72℃延伸10min，于4℃=保存，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳，溴乙錠染色后，于凝膠成像儀上觀察并照相記錄，實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照。

1.4 ISSR-PCR擴(kuò)增程序優(yōu)化

以第2輪均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，對(duì)建蘭ISSR-PCR擴(kuò)增程序中的循環(huán)次數(shù)和退火溫度進(jìn)行篩選優(yōu)化，循環(huán)次數(shù)設(shè)3個(gè)梯度：30、32和35次；退火溫度范圍為50－56℃，變化梯度為1℃。

1.5 優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序的驗(yàn)證

通過(guò)增加模板數(shù)量、更換引物以及重復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)所用引物，參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套ISSR引物序列。由上海生工生物工程有限公司合成，Mg²⁺，dNTP和TaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR體系的均勻優(yōu)化

第1輪4因素5水平均勻設(shè)計(jì)共20個(gè)處理組合的ISSR-PCR體系的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1.從圖1可以看出，不同因素水平組合的ISSR-PCR體系的擴(kuò)增結(jié)果差異顯著：組合1和9沒(méi)有擴(kuò)增，組合4和18有少量擴(kuò)增產(chǎn)物，但無(wú)法辨識(shí)；組合2和15擴(kuò)增帶譜彌散，難以區(qū)分；組合7、8和19擴(kuò)增帶譜強(qiáng)，但有拖帶現(xiàn)象，辨識(shí)困難；組合5、6、13、14、16、17和20擴(kuò)增帶譜少，其中組合5和6帶譜也很弱；綜合擴(kuò)增帶譜的數(shù)目、強(qiáng)弱、清晰度和可分辨率等指標(biāo)，組合11是比較理想的模式，因此，初選組合11(20μL反應(yīng)體系中，含Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶lU，模板DNA 40ng)作為第1輪均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的結(jié)果。

為獲得理想的ISSR-PCR體系，在組合11對(duì)應(yīng)的因素水平基礎(chǔ)上，進(jìn)行第2輪均勻設(shè)計(jì)篩選，圖2為第2輪4因素3水平均勻設(shè)計(jì)共12個(gè)處理組合的ISSR-PCR體系的擴(kuò)增結(jié)果，由圖2知，12個(gè)組合中，組合3、4、8和12擴(kuò)增帶譜少且弱，效果差；組合1和2擴(kuò)增帶譜數(shù)較多，強(qiáng)弱較均勻且清晰可辨，是比較理想的擴(kuò)增模式，相比而言，組合2較組合1，帶譜強(qiáng)弱差異更小、明晰可辯，故確定組合2(20μL反應(yīng)體系中，含Mg²⁺2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物0.25μmol/L，Taq DNA聚合酶1.5U，模板DNA 40ng)為建蘭ISSR-PCR體系的第2輪均勻設(shè)計(jì)篩選結(jié)果。

2.2 循環(huán)次數(shù)和退火溫度對(duì)ISSR-PCR的影響

PCR循環(huán)次數(shù)的多寡，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響十分顯著，理論上，循環(huán)次數(shù)越多，擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)率越高，但實(shí)際上，擴(kuò)增產(chǎn)率會(huì)受反應(yīng)體系中各反應(yīng)組分用量的限制，如循環(huán)次數(shù)超過(guò)40，則酶的消耗達(dá)到一個(gè)平臺(tái)，產(chǎn)率很難再提高，為獲得理想的擴(kuò)增效果，以第2輪均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的反應(yīng)體系，在原擴(kuò)增程序的基礎(chǔ)上，分別測(cè)試了30、32和35個(gè)循環(huán)(其它條件不變)對(duì)建蘭ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響，圖3 A、B和C分別為30、32和35次循環(huán)的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果，不難看出，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，擴(kuò)增帶譜由弱變強(qiáng)，表明隨著循環(huán)次數(shù)的增加擴(kuò)增產(chǎn)率呈較明顯的遞增趨勢(shì)，比較而言，32次循環(huán)對(duì)建蘭ISSR-PCR的擴(kuò)增是適宜的。

ISSR引物對(duì)PCR退火溫度極為敏感，同一引物，對(duì)不同的物種其退火溫度不盡相同；同樣，對(duì)同一物種，不同的引物其退火溫度亦不盡相同，因此，不同引物退火溫度的篩選需反復(fù)調(diào)試，本實(shí)驗(yàn)從100個(gè)ISSR引物(UBC公布的第9套引物)中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性較好的14個(gè)引物用于PCR擴(kuò)增，14個(gè)ISSR引物的退火溫度在52－56℃之間，其中，引物UBC807、UBC836、UBC857的退火溫度為56℃；引物UBC828、UBC835、UBC841、UBC845、UBC852、UBC853的退火溫度為54℃；引物UBC814、UBC815的退火溫度為53℃；引物UBC808、UBC825、UBC827的退火溫度為52℃，

2.3 優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序的驗(yàn)證

應(yīng)用上述優(yōu)化的ISSR-PCR體系和擴(kuò)增程序，用篩選的14個(gè)引物，對(duì)36個(gè)建蘭品種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能獲得豐富、清晰可辨的DNA帶譜，圖4是引物UBC828對(duì)36個(gè)建蘭品種DNA的擴(kuò)增結(jié)果。

3 討論

均勻和正交設(shè)計(jì)可以解決多因素、多水平試驗(yàn)中，各因素、水平間的交互效應(yīng)，與正交設(shè)計(jì)對(duì)比，均勻設(shè)計(jì)的最大優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)次數(shù)大大減少，如本研究的第1輪實(shí)驗(yàn)，若運(yùn)用正交設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)處理組合數(shù)為100，是均勻設(shè)計(jì)處理組合數(shù)20的水平數(shù)(5)倍，對(duì)于水平數(shù)高的多因素試驗(yàn)，運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)顯然可以事倍功半。

本研究應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)，只經(jīng)兩輪實(shí)驗(yàn)，就獲得了建蘭ISSR-PCR體系的優(yōu)化組合，但由于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)判指標(biāo)是定性的，無(wú)法用數(shù)學(xué)方法進(jìn)行定量分析，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果未必是最佳，進(jìn)一步的改進(jìn)，可以從以下幾方面著手：1)將擴(kuò)增產(chǎn)物量化，量化后可用線性回歸等數(shù)學(xué)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析，從中求得最佳；2)增加試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，重復(fù)次數(shù)增大，可供選優(yōu)的幾率增加，但工作量也將成倍增加；3)縮小各因素水平問(wèn)的差值，水平間的差值減小，結(jié)果的評(píng)判指標(biāo)差異縮小，對(duì)優(yōu)選有益，但上作量隨之增加，結(jié)果評(píng)判的人為影響亦增大。

由于ISSR引物較長(zhǎng)(16－18個(gè)堿基序列)，以及5′端或3′端1－4個(gè)錨定堿基與互補(bǔ)的SSR序列的耙定作用，要求退火溫度較RAPD高，另外，不同ISSR引物對(duì)退火溫度的要求不一，因此，對(duì)IS－SR-PCR擴(kuò)增程序中的退火溫度，應(yīng)針對(duì)不同引物進(jìn)行篩選，以期獲得穩(wěn)定、可靠的標(biāo)記結(jié)果。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。