腦靈湯對老年性癡呆大鼠智力及其相關因素的影響

摘要：目的探討腦靈湯對老年性癡呆大鼠的干預機制。方法采用Y－迷宮測試大鼠的智力；采用生化法檢測大鼠血清總膽固醇(TC)含量和放射免疫法(RTA)測定大鼠腦淀粉樣前蛋白(APP)、β－淀粉樣肽(Ap)含量。結果 腦靈湯組能明顯改善老年性癡呆大鼠智力，其學習記憶能力明顯提高(P＜0.05)；血清總膽固醇及腦內APP、Aβ含量顯著降低，差異均有統計學意義(P＜0.01)。結論腦靈湯對老年性癡呆大鼠有明顯的干預作用，其機制可能與降低血清總膽固醇、抑制APP的產生、減少腦組織Aβ含量，從而提高其智力能力。

關鍵詞：腦靈湯；老年性癡呆大鼠；淀粉樣前蛋白；β－淀粉樣肽

中圖分類號：R749.1 R255.2 文獻標識碼：A 文章編號：1672—1349(2007)04—0310—03

老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AID)是一種以進行性智能減退為主要特征的老年神經系統退行性疾病。老年斑是其主要病理性特征之一。臨床表現為記憶功能喪失、智力減退和行為人格退化。腦病理研究發現，β淀粉樣肽(Aβ)是老年斑的核心成分，AD病人腦組織內Aβ明顯增多，并形成大量的老年斑。老年斑、神經原纖維纏結和血管壁淀粉樣變是AD大腦的特征性病理改變，而Aβ是老年斑和血管壁淀粉樣變性的主要成分^[1，2]。為此，本實驗從益腎健脾、祛痰清瘀立法組方，觀察腦靈湯對AD大鼠血清總膽固醇(TC)及其腦內淀粉樣前蛋白(APP)、Aβ含量的影響，從而探討其防治AD的作用機制，為臨床治療AD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用健康4月齡SD(Spragu－Dawley)大鼠72只(中南大學湘雅醫學院實驗動物中心提供)，雌雄各半，體重180 g～220 g。合格證號[(湘)－2004－0013]領回后在實驗室動物房喂養，喂養期間自由飲水和進食，保持充足的光照和通風。

1.2 實驗藥物及主要試劑腦靈湯濃縮液(由何首烏、白參、紅景天等八味藥組成)，湘雅二醫院制劑科配制，每毫升成藥液含生藥2.9 mg。舒降之(辛伐他汀片)：用前用雙蒸水經超牛細胞粉碎機制成濃度4 g/L的混懸液，藥物配制后置4℃冰箱保存備用，用前搖均(杭州默沙中制藥有限公司，20 mg×7粒)。APP的N末端抗體由Sigma公司生產；Aβ試劑盒天津九鼎醫學生物工程有限公司生產，血清TC試劑盒首都醫科大學首醫臨床科技中心提供。

1.3 主要儀器Y型電迷宮箱(中南大學湘雅醫學院神經生物中心提供)，臺式高速冷凍離心機(湖南儀器儀表總廠離心機廠生產)，微機多探頭7計數器(上海瀘西分析儀器廠生產)，全自動生化分析儀(荷蘭威圖Selectrac生產)，流式細胞儀(美國BECKMAN公司生產)，紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠生產)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組共篩選出72只SD大鼠，再將這72只大鼠隨機分為對照組、模型組、西藥組(舒降之組)、中藥組(腦靈湯組)，每組各18只。

1.2.2 模型制備實驗大鼠喂飼高膽固醇飼料(1％膽固醇)，2周后檢測血清總膽固醇含量，給藥組開始給藥，持續8周，進行學習記憶測試，然后取血和腦組織，進行各項指標觀察，進行學習記憶測試并取血和腦組織進行檢測。對照組大鼠喂飼普通飼料。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠學習記憶能力檢測 行為學測試于AID模型建立前后及腦靈湯／舒降之處理各時間段(20d及30 d)進行，均予Y－迷宮測試，方法：將大鼠放入Y－迷宮箱中，適應5min，使其熟悉－迷宮箱的3個臂的內部結構，然后從1個臂開始隨機測試，給(30～70)V，電流(0.5～0.7)mA，電擊后大鼠逃避至安全區為正確反應，否則為錯誤反應。每測1次休息30 s，測10次休息5 min。大鼠學習記憶能力以連續10次測試中有9次為正確反應時，所需的電擊次數表示。數值越小表示大鼠的學習記憶能力越好；數值越大表示大鼠的學習記憶能力越差，記錄每只大鼠學會逃避電刺激所需的次數。若次數超過30次則不再測試，并以30次為最大值記數。

1.3.2 腦APP含量測定采用放射免疫法(RTA)：實驗大鼠采血后，斷頭處死，手術迅速將腦組織取出，冰臺上快速分離大鼠左、右半大腦，除去小腦及腦橋。用Tris－HCI緩沖液勻漿，10 000 r/min離心10 min。取上清液檢測APP含量(ng/mg)。嚴格按照天津九鼎醫學生物工程有限公司APP試劑盒說明書操作，結果由γ計數器得到校正的APP含量。

1.3.3 腦Aβ含量測定 斷頭處死后，冰臺上快速分離大鼠左、右半大腦，除去小腦及腦橋，加入2.5倍量的冰生理鹽水，在冰浴下超聲波破碎制成40％的勻漿，4℃低溫離心機中10000 r/min離心10 min，取上清液用放免法測Aβ的含量，按Aβ試劑盒方法操作。

1.3.4 血清TC的測定采用生化法：大鼠于末次給藥后1 h腹主動脈放血，4℃放置4 h后，3000 r/min離心20 min，取上清液，按國產試劑法，取10uL血清1.0 mL試劑，37℃反應10 min，于荷蘭威圖SelectraE全自動生化測定儀在520 nm比色，以試劑空白校零，計算公式為：樣品中膽固醇含量(mmol/L)=A測定／A標準x標準濃度。

1.4 統計學處理采用SPSS 11.5進行數據分析。實驗數據以均數±標準差

表示，配對t檢驗進行組內分析，造模前后學習記憶成績與對照組的比較采用t檢驗；藥物對腦APP含量、腦Aβ含量和血清總膽固醇含量的影響及各組治療后學習記憶成績所得數據用單因素方差分析，a=0.05。

2 結 果

2.1 腦靈湯對老年癡呆大鼠學習記憶的影響(見表1) 治療后20 d、30 d各組大鼠電迷宮實驗學習記憶能力測試比較，記錄模型組和對照組大鼠造模前后Y－迷宮學習記憶成績。結果說明，喂飼高膽固醇飼料后大鼠學習記憶功能明顯減退，提示模型復制成功。但治療用藥后，腦靈湯組和舒降之組可明顯改善動物的學習記憶力，而兩組之間無明顯差異。

2.2 各組大鼠大腦組織勻漿APP、Aβ含量的比較在治療8周后斷頭取大鼠大腦組織，檢測其APP、Aβ含量，結果顯示：對照組、腦靈湯組、舒降之組腦APP、Aβ含量和模型組比較均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。腦靈湯組與舒降之組相比較，腦APP、Aβ含量有統計學意義(P＜0.05)。詳見表2。

2.3 腦靈湯對大鼠血清TC水平的影響 造模前受試動物的血脂水平均為正常。造模2周后，模型組與對照組比較，血清TC明顯升高(P＜0.01)，表明高膽固醇血癥造模成功。與模型組比較，腦靈湯組、舒降之組血清TC均明顯降低(P＜0.001)。與舒降之組比較，腦靈湯組血清TC明顯降低(P＜0.05)。詳見表3。

3 討 論

中醫古籍沒有老年性癡呆的病名，根據本病的常見臨床表現，應屬中醫“呆癡”“郁證”等范疇。祖國醫學認為AID的發生多與肝腎不足、腦髓不充，或飲食失宜，氣血虛弱，腦神失養有關；此外，中毒、外傷等損傷腦臟，遷延日久火邪、痰濁、瘀血阻塞清竅均可導致AD發生，出現失憶、失認失算、失斷(判斷)等臨床表現。

學習智能障礙是AD的主要癥狀。目前研究AD所用的模型大多為各種理化方法所致的學習記憶障礙模型。如M受體阻滯劑、蛋白質或DNA合成抑制劑、缺氧、電損毀或化學損毀海馬、隔區等局部區域等。而本實驗采用實驗大鼠喂飼高TC飼料(1％膽固醇)，造成高TC血癥，進而使Aβ生成增多，出現學習記憶能力損傷、Aβ沉積等AD的特征樣改變的方法制作復合老年性癡呆的動物模型。高膽固醇致Aβ增高老年性癡呆大鼠模型目前在國外普遍使用^[3，4]，該方法造模簡便易行且有比較肯定的證據表明：高膽固醇能致Aβ增高產生擬衰老反應。故以喂飼高膽固醇方法復制的老年學習記憶障礙模型應是研究AD較為理想的模型之一。

大多數學者認為，AG在腦內的異常沉積是AD發病較為初始的因素，在AD發病機制中具有關鍵作用^[5]。有關AD的發病機制，目前普遍認為是Aβ病因學說。Aβ由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產生。AD病人海馬區APP751水平2倍高于非AD海馬區的APP。APP功能和學習記憶密切相關，促進神經細胞生長分化，增加神經突觸的可塑性，及參與信號傳導，促進細胞黏附^[6]。而細胞內膽固醇的含量對APP和Aβ代謝影響很大，在細胞內轉運膽固醇(NPC)腦內，由于神經原纖維改變(AID的核心病變之一)，可能與膽固醇異常代謝有關。Aβ在腦內異常凝集分子基礎可能與膽固醇參與促進可溶性AJ3的凝集的特異性。Aβ的形成依賴細胞內膽固醇，膽固醇的代謝隨著年齡而改變，是AD以腦的老化為基礎而發病的分子機制，膽固醇在其中起關鍵性作用^[7]。針對Aβ纖維在AD發病中的關鍵作用，研究如何阻斷和延遲AD早期Aβ的積聚以及如何消除已形成的Aβ斑塊沉積為治療AD提供了切入點。

因此，根據老年性癡呆的發病特征及痰瘀阻竅、腎精虧虛這一原則，采用腦靈湯益腎健脾、活血化瘀、開竅滌痰，經臨床驗證，該方在改善老年癡呆病人學習、記憶能力方面有顯著療效。本次實驗通過測定AD大鼠血清TC及腦內Aβ、APP水平來探討腦靈湯治療AD的作用機制，結果顯示：經該方治療后模型大鼠學習、記憶明顯改善；腦內Aβ、APP含量明顯下降。該方和西藥相比，在降低血清TC及腦內Aβ、APP含量方面明顯優于西藥舒降之組(P＜0.05)。提示腑靈湯能夠降低AD大鼠血清總膽固醇水平、抑制APP的產生、減少腦組織Aβ含量從而改善大鼠的學習、記憶能力，對AD具有一定治療作用。

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作者簡介：裴異(1974—)，女，畢業于湖南中醫藥大學，主治醫師，醫學碩士，現工作于湖南省長沙市中心醫院(郵編：410003)；何明大，工作于中南大學湘雅附屬二醫院；黃孟軍，工作于廣西中醫學院研究生院。

(本文編輯 郭懷印)

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文”