木瓜中齊墩果酸的提取、分離及鑒定

摘 要:從木瓜中提取#65380;分離#65380;鑒定齊墩果酸#65377;方法:采取回流法#65380;索氏提取法和冷浸法從木瓜中提取齊墩果酸，然后采用酸堿沉降法#65380;氯仿萃取法分離純化，并用高效液相色譜法進行鑒定#65377;結果:結果顯示回流法提取效果最好#65377;結論:為齊墩果酸的工業化生產提供了一定的理論依據#65377;

關鍵詞:木瓜;齊墩果酸;提取;分離;高效液相色譜法

0 前言

木瓜，又稱皺皮木瓜，鐵腳犁，酸木瓜等，為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠的果實#65377;木瓜是具有食用，藥用觀賞的多用途植物，果實成熟后，色澤金黃，氣味芳香，果實營養極為豐富#65377;齊墩果酸(Oleanolic acid)，分子式為C30H48O3，是木瓜的主要有效成分，別名土當歸酸，大部分以游離酸或糖苷的形式存在，為五環三萜類化合物，是我國首次從植物中發掘出來的，是治療急性黃疸型肝炎和慢性病毒性肝炎比較理想的藥物#65377;

本實驗以干木瓜為原料，在單因素實驗的基礎上設計正交實驗，優化提取齊墩果酸的最佳工藝條件#65377;通過酸堿沉降或氯仿萃取的方法分離純化，最后經高效液相色譜法對其進行鑒定#65377;該種方法準確可靠，為初步研究建始木瓜中齊墩果酸提供試驗基礎，為齊墩果酸的工業化生產提供了一定的理論依據#65377;

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

干木瓜片，粉碎機粉碎

1.1.2 試驗的主要儀器和設備

HHS型電熱恒溫水浴鍋，RE52-99型旋轉蒸發器，722可見分光光度計，紫外分光光度計，電子天平，分析天平 ，液相設備，分析柱:Hypersil ODS25μm #65377;

1.1.3 試驗主要試劑

95%工業酒精，分析醇的95%乙醇 #65380;甲醇#65380;冰醋酸#65380;高氯酸#65380;濃硫酸#65380;乙酸乙酯#65380;香草醛，齊墩果酸標準品#65377;

1.2 方法

1.2.1 齊墩果酸提取方法的比較

(1)回流提取法:稱取木瓜粉25g，分別用100ml，80ml，70ml的95%工業酒精在60℃下回流提取，時間依次為4，3，2小時，合并提取液，用乙醇定容至250ml，作為供試樣#65377;

(2)索氏提取法:稱取木瓜粉25g，用95%工業酒精在索氏提取器中提取，在90℃下至虹吸下溶液近無色(約8小時)，將提取液轉移至250ml容量瓶，定容至刻度作為供試樣#65377;

(3)冷浸提取法:稱取木瓜粉25g，用95%工業酒精150ml浸提一周，再用100ml乙醇浸提5天，合并浸提液，將提取液轉移至250ml容量瓶，定容至刻度作為供試樣#65377;

1.2.2 比色法測定齊墩果酸的含量

精密稱取香草醛0.3g，用移液管加入6ml冰醋酸，配置成5%香草醛-冰醋酸溶液#65377;分別取回流法，索氏提取法和冷浸法提取的樣品0.01ml(每種做3個平行)加入試管中，加熱揮發溶劑，試劑空白為對照#65377;精密加入新制的香草醛-冰醋酸0.2ml和高氯酸0.8ml，在70℃恒溫水浴加熱15分鐘#65377;流水冷卻至室溫，精密加入乙酸乙酯4ml，搖勻，在波長560nm處測定吸光值，比較三種方法提取率#65377;

1.2.3 回流提取的單因素實驗

(1) 溫度對提取率的影響:分別稱取10g木瓜粉，以95%工業酒精，料液比為1:15，按40，50，60，70，80℃五個溫度梯度提取9h，提取3次，合并提取液，定容至250ml#65377;分別取0.01ml提取液加入試管中，通過比色法測定齊墩果酸的含量(每個樣品3個平行)#65377;

(2)時間對提取率的影響:分別稱取10g木瓜粉，以95%工業酒精，料液比為1:15，按3h，5h，7h，9h，11h五個時間梯度，置于60℃水浴鍋，提取3次，時間間隔分別為1.5，1，0.5h;2.5，1.5，1h;3，2.5，1.5h;4，3，2h;4.5，3.5，3h#65377;合并提取液，定容至250ml#65377;分別取0.01ml提取液加入試管中，通過比色法測定齊墩果酸的含量(每個樣品3個平行)#65377;

(3)料液比對提取率的影響:按料液比為1:5，1:10，1:15，1:20，1:25，以95%工業酒精，置于60℃水浴鍋中9h，提取3次，每次的溶劑用量為25，15，10ml;50，30，20ml;70，50，30ml;90，70，40ml;100，80，70ml#65377;合并提取液，定容至250ml#65377;分別取0.01ml提取液加入試管中，通過比色法測定齊墩果酸的含量(每個樣品3個平行)#65377;

1.2.4 正交試驗優化回流提取的工藝

在單因素實驗基礎上，考察溫度(A)，提取時間(B)，料液比(C)3個因素，每個因素3個水平，進行正交實驗#65377;因素-水平表見表1-1所示#65377;

1.2.5 齊墩果酸的分離純化

(1)酸堿沉降法:準確稱取4gNaOH固體，加入100ml水，配成1mol/ml的NaOH溶液#65377;量取10ml濃硫酸，將其緩慢倒入90ml水中，配成10%硫酸溶液#65377;取一份回流供試樣將其旋轉真空濃縮，濃縮成浸膏狀物，回收乙醇，浸膏狀物質用1mol/lNaOH溶液煮40分鐘，趁熱過濾，重復3次，合并濾液#65377;用10%硫酸溶液調pH=1，沸水浴4小時，氯仿萃取#65377;蒸餾回收氯仿，得固體齊墩果酸用甲醇定容至100ml#65377;

(2)氯仿萃取法:取一份回流供試樣將其旋轉蒸發，濃縮成浸膏狀物，回收乙醇，所得浸膏狀物質先后用水和氯仿洗滌，合并洗滌液，去水層，有機層用水洗滌6次，去水層，蒸餾氯仿，所得齊墩果酸用甲醇定容至100ml

1.2.6 齊墩果酸的HPLC鑒定

(1)色譜條件:色譜柱為ODSC18色譜柱，柱溫25℃，流速1ml/min，紫外檢測波長215nm，流動相為甲醇:水:乙酸=90:10:0.1#65377;

(2)標準溶液的配制:準確稱取10mg的齊墩果酸標準品，加甲醇溶解，置于10ml帶刻度的試管中，配成1mg/ml的對照品溶液#65377;

(3)標準曲線的制作:用取樣槍準確吸取0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml對照品溶液，加甲醇補充至10ml，混合均勻，得到濃度為0.01mg/ml， 0.02mg/ml， 0.03mg/ml， 0.04mg/ml， 0.05mg/ml的齊墩果酸標準溶液#65377;每次取20μl進樣，測定其峰面積#65377;以齊墩果酸濃度(x)和峰面積(y)求回歸方程#65377;

(4)精密度測定:取上述對照品20μl，重復5次進樣，測定各自峰面積#65377;

(5) 重復性實驗:取同一樣品平行制備5份供試品溶液，在上述同樣色譜條件下分別進樣20μl，測定其峰面積#65377;

(6)加樣回收實驗:準確量取已知含量的齊墩果酸樣品溶液1ml，加入0.2mg的齊墩果酸標準品，做5個平行，在上述色譜條件下分別進樣20μl，測定其峰面積#65377;

2 結果與分析

2.1 提取方法的比較

木瓜中齊墩果酸的提取法主要有回流提取法，索氏提取法，冷浸提取法等方法，三種提取方法中，回流提取的效果明顯好于其他兩種方法，索氏提取所需溫度在80℃以上，可能會對齊墩果酸的結構造成破壞，而冷浸則提取溫度相對較低，提取不完全，故而這兩種方法的提取率低于回流法提取#65377;因此，本研究采用回流提取法進行下一步試驗，并在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化提取工藝#65377;

2.2 單因素實驗

2.2.1 溫度對提取率的影響

為了選擇正交試驗合適的溫度條件，用95%的工業酒精，在相同的提取時間，料液比的條件下，對溫度進行單因素試驗，其提取率的變化情況在40℃-70℃范圍內，隨著溫度的升高，分子的活性增大，擴散速度加快，浸出速度也加快，因此提取率升高，在70℃處為最大值，但是80℃時提取率有所下降，一方面可能是由于溫度過高對齊墩果酸的結構產生破壞，另一方面則可能是因為溫度過高引起乙醇的揮發，造成溶劑損失#65377;因此選定50℃，60℃，70℃作為正交試驗的溫度因素的三個水平#65377;

2.2.2 時間對提取率的影響

在相同的提取溫度，料液比的條件下分別控制不同的提取時間，考察提取時間對提取效果的影響#65377;其提取率的變化情況顯示:提取時間短則齊墩果酸來不及溶出，提取率較低，隨著時間的延長，木瓜中齊墩果酸的提取率逐漸增高，其增長率分別為94.9%，9.5%，8.4%，1.7%#65377;由此可以看出，5h以后提取率的增長逐漸趨于緩和#65377;提取時間的延長雖然可以提高提取率，但是長時間的提取雜質的溶出率也會相應升高#65377;因此從經濟高效等原因考慮，為節約時間#65380;降低能耗，選擇5h，7h，9h作為正交試驗中時間因素的三個水平#65377;

2.2.3 料液比對提取率的影響

在相同的提取溫度，時間的條件下，分別選取不同的料液比，考察其對提取效果的影響#65377;其提取率的變化情況顯示，

隨著料液比的升高，由于溶劑的量的增加，其提取率也相應的不斷增加，增長率分別為73.9%，37.7%，60.4%，4.9%#65377;由此可以看出，當料液比達到1∶20以后，提取率的上升趨勢逐漸趨于平緩#65377;在實驗條件范圍之內，料液比1∶25時為最大提取率#65377;但是料液比不宜過多，否則不僅浪費溶劑，而且增加濃縮工作量#65377;因此選擇1∶5，1∶20，1∶25作為正交試驗料液比因素的三個水平#65377;

2.3 正交實驗優化提取工藝

以乙醇為溶劑的三因素三水平正交實驗結果見表2-1，對表中齊墩果酸的提取率進行方差分析和顯著性檢驗結果見表2-2#65377;正交實驗和數據分析的結果表明，溫度，時間，料液比對提取率影響的大小為溫度>時間>料液比#65377;木瓜中齊墩果酸的最佳提取條件為A3B3C3即:溫度70℃，提取時間9h，料液比1∶25#65377;

2.4 高效液相色譜法鑒定齊墩果酸

用外標法對進行定量分析，標準品及標準品與回流提取純化樣品對比的HPLC圖譜分別見圖1#65380;2#65380;3#65377;經計算得木瓜中齊墩果酸的含量為1.28mg/g#65377;

色譜條件:ODSC18色譜柱，柱溫25℃，流速1ml/min，紫外檢測波長215nm，流動相為甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1

色譜條件:ODSC18色譜柱，柱溫25℃，流速1ml/min，紫外檢測波長215nm，流動相為甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1

1:齊墩果酸標準品2:氯仿萃取純化樣品

色譜條件:ODSC18色譜柱，柱溫25℃，流速1ml/min，紫外檢測波長215nm，流動相為甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1

1:齊墩果酸標準品2:酸堿沉降純化樣品

2.4.1 線性關系考察

如圖4所示，以標準品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到回歸方程y = 4099733x + 22375，r2=0.9918，結果表明齊墩果酸在0.01-0.05mglml與峰面積呈良好的線性關系#65377;

色譜條件:ODSC18色譜柱，柱溫25℃，流速1ml/min，紫外檢測波長215nm流動相為甲醇:水:乙酸=90:10:0.1

2.4.2 精密度實驗

用標準品溶液重復進樣5次，每次進樣20ìl，齊墩果酸峰面積值RSD為2.23%<5%，精密度良好#65377;

2.4.3 重復性實驗

取同一樣品平行制備5份供試品溶液，在上述同樣色譜條件下分別進樣20ìl，測定其峰面積，所得RSD值為3.45%<5%，靈敏度良好#65377;

2.4.4 加樣回收實驗 

準確量取1.28mg/g的齊墩果酸樣品溶液1ml，加入0.2mg的齊墩果酸標準品，做5個平行，測定其峰面積，經計算其平均加樣回收率為97.8%，準確度良好

3 討論

3.1 關于提取

有報道用氯仿，甲醇作為提取溶劑，本實驗所選用的溶劑為95%工業酒精#65377;在這三種提取方法中，索氏提取與回流法都需要加熱，實驗結果也相差不大，但回流法的實驗條件更易于控制，冷浸法不需要加熱，但是花費時間長#65377;

3.2 關于比色法測含量

可以與齊墩果酸發生顯色反應的試劑有十余種，資料表明用這些試劑顯色，都可進行齊墩果酸比色測定#65377;但經本實驗發現，用香草醛-濃硫酸試劑顯色，雖然吸光值較大，但是除試劑空白顏色較深外，更主要的是穩定性差，甚至同時做的平行試樣，時間稍有不同吸光值就有變化#65377;因此，本實驗選用香草醛-高氯酸為顯色劑#65377;用此方法顯色時應注意以下幾個問題:①水分對測定有干擾，因此容器必須充分干燥;②提取的樣品在揮去溶劑時不能過熱，否則齊墩果酸的結構會被破壞，這樣會影響測定結果;③5%香草醛-冰醋酸溶液必須臨用前新鮮配制，否則顯色靈敏度會下降，這可能與香草醛易于被空氣中的氧氧化有關;④香草醛和冰醋酸都容易揮發，因此加樣時動作要迅速#65377;

3.3 關于高效液相色譜法鑒定齊墩果酸

在色譜條件的建立過程中，開始使選擇了80%的甲醇作為流動相，但是實驗圖譜顯示并沒有將齊墩果酸分離出來，之后在甲醇中添加了1%的冰醋酸，取得了較好的分離效果#65377;在進一步實驗的基礎上，最終確定了甲醇∶水∶冰醋酸=90∶10∶0.1為流動相，保留時間在7min左右#65377;需要注意的是，流動相配制好后應混合均勻，否則會對保留時間有所影響#65377;經過對齊墩果酸標準樣品的紫外掃描，確定了215nm為檢測波長#65377;

3.4 關于發展前景

齊墩果酸結構復雜，人工合成步驟繁多，目前仍依賴從植物中提取得到，雖然借助越來越先進的技術和越來越精密的儀器，今后人工合成的比例會越來越大，但由于從植物中提取得到的齊墩果酸為天然藥物，對人體無任何毒副作用，加之齊墩果酸在植物中分布較廣，藥源比較豐富，在天然藥物開發利用已成為世界潮流的今天，齊墩果酸提取的前景仍很廣闊#65377;

4 結論

(1)通過不同提取方法的比較，選定回流提取為本研究的提取方法#65377;

(2)木瓜中齊墩果酸的回流提取最佳工藝條件為溫度70℃，提取時間9h，料液比1∶25#65377;

(3)分離純化后進行HPLC鑒定，建立的色譜條件為ODSC18色譜柱，柱溫25℃，流速1ml/min，紫外檢測波長215nm，流動相為甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1#65377;測得干木瓜中齊墩果酸的含量為1.28mg/g，該方法操作簡便，準確度高#65377;

參考文獻

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