基于DNA條形碼—產地—形態分析聯用的巴西草藥PIC?O(鬼針草)的鑒定及生藥學研究

顧選 張曉芹 宋曉娜 李妍芃 韓麗 趙百孝 劉春生 馬長華 哈略

鬼針草類藥材均來源于菊科管狀花亞科鬼針屬Bidens L.植物，為一年生草本植物。鬼針草類藥材藥用歷史悠久，為許多國家使用。中國的鬼針草藥材來源有鬼針草B．pilosa、金盞銀盤B．biternata、小花鬼針草B．parviflora等植物的干燥全草［1］，其具清熱解毒、活血散瘀功能，主治上呼吸道感染、咽喉腫痛、急性黃疸型傳染性肝炎等［2］。巴西號稱“植物王國”，境內植物資源居世界首位。在巴西的部落里，鬼針草藥材(PIC?O)的應用也十分廣泛。通過調查，巴西鬼針草具有利尿，凈化血液，消炎，保護肝臟，抗病菌，抗原生動物，退燒解熱作用，用于治療黃疸病、泌尿感染，陰道感染以及皮膚病的輔助治療等。比較中巴鬼針草的治療作用和臨床應用情況，有利于促進中國和巴西的醫學交流，擴大草藥的用藥范圍。但是，巴西鬼針草來源尚不明確，限制了草藥的開發利用。

DNA條形碼技術具有鑒別無背景信息中藥材的優勢，能夠準確鑒別到屬、種水平，產地和形態特征能進一步驗證DNA條形碼鑒定結果［3］。本研究通過DNA條形碼技術—產地—形態分析聯用的方法對巴西鬼針草進行基原鑒定研究，明確藥材的來源。通過性狀鑒別和顯微鑒別法對巴西鬼針草進行生藥學研究，從器官、組織和細胞三個層次為藥材鑒別提供依據，對藥材的開發利用和質量控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2012年4月采購巴西藥用鬼針草3批，購自巴西隆城市場。樣品的憑證標本保存于北京中醫藥大學大學標本室。

1.2 試劑

廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司，批號:69632855)、Taq酶等PCR試劑(上海生工生物工程有限公司，批號:695673BE)、乙醇、瓊脂糖、ddH2O 等。

1.3 儀器

SIGMA3K-15低溫高速離心機(SIGMA公司)，TECHNE TC-3000PCR擴增儀，Bio-Rad電泳儀，水平電泳槽(北京六一儀器廠)，JS-680B全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)，GRANT制冰機，超純水制備系統，KQ5200E型超聲波清洗器，SANYO-80℃超低溫冰箱(SANYO公司)，DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.4 DNA提取及PCR擴增

取樣品，觀察形態，形態結果一致。取葉片進行DNA提取。各份樣本分別用液氮冷凍后研磨成細粉，采用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。采用ITS序列通用引物在熱循環擴增儀上進行擴增，PCR擴增條件:50μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物P1和P4各加2.5μL(5μmol/L)，DNA模板4μL，ddH2O 16μL。PCR擴增程序:94℃預變性5分鐘，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸 1分鐘，40個循環后，72℃延伸 10分鐘［3］。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下檢視，均由上海生工生物工程有限公司測序部測序。各樣品均采用正向和反向測序，以保證測序的準確性。

1.5 序列分析方法

利用ContigExpress軟件對測序獲得的正、反向序列進行拼接，根據相似度搜索法(BLAST法)所獲相似度最高物種的同屬ITS序列邊界，截取待鑒定物種的ITS序列，分析樣品序列特征。

1.6 基于DNA條形碼的鑒定方法

根據相似度法鑒別物種:以90%作為屬水平鑒定的閾值，以97%作為種水平的鑒定閾值。當物種相似度在97%以上，最高相似度物種為鑒定結果;當最高相似度物種相似度低于97%時，認為數據未注冊該序列，鑒定到屬水平。

1.7 基于產地分析的鑒定方法

根據“基于DNA條形碼鑒定方法”項下獲得的科、屬和種的鑒定結果，依據巴西植物志記載的巴西分布的該屬植物物種信息，依次分析最高相似度物種的產地是否相符合。

1.8 基于形態分析的鑒定方法

根據“基于產地分析的鑒定方法”項下獲得的鑒定結果，查詢巴西植物志的形態信息，核對形態特征，進一步證實鑒定物種結果和入藥部位。

1.9 巴西鬼針草的性狀和顯微特征研究

根據2010版《中華人民共和國藥典》(一部)中方法分析樣品性狀特征、顯微橫切特征、顯微粉末特征。

2 結果與分析

2.1 基于DNA條形碼的鑒定

樣品的測序峰圖良好，3份平行樣測序結果一致，各選擇一條序列用于后續分析。截取ITS片段，ITS序列長度為646 bp。經BLAST功能檢索，樣品與菊科鬼針草屬植物相似度最高，均大于97%;與植物鬼針草B．pilosa序列(U67106.1)相似度最高，相似度為99%。因此，通過DNA條形碼技術鑒別該藥材基原為菊科植物鬼針草B．pilosa。

2.2 基于產地分析的驗證

根據調查，巴西部落有鬼針草植物分布，DNA條形碼鑒定結果符合植物地理分布特征。因此，根據DNA條形碼與產地核對結果鑒定巴西鬼針草來源于菊科植物鬼針草。

2.3 基于形態分析的驗證

莖鈍四棱形，如圖1，葉為三出羽狀復葉，小葉基部近圓形或闊楔形，有時偏斜，不對稱，具短柄，邊緣有鋸齒、頂生小葉較大，長橢圓形或卵狀長圓形。葉面具柔毛。根據形態分析，巴西鬼針草與植物志中鬼針草特征相符合，因此，根據DNA條形碼-產地-形態分析的研究結果，鑒定巴西鬼針草的來源為菊科植物鬼針草B．pilosa的地上部分。

圖1 巴西鬼針草PIC?O樣品的性狀

2.4 巴西鬼針草的性狀和顯微研究

2.4.1 性狀特征 從性狀上看，樣品經過切制加工，莖呈方形或近圓柱形，多切成段，長短不一，一般老莖較短，嫩莖較長。表面紫紅色或紫棕色，少量或灰綠色或棕黃色，有縱向棱槽，莖上微附茸毛，節間明顯，節膨大。質輕，易折斷。斷面白色，髓部海綿狀，近節處或有中空。葉片皺縮卷曲，完整者展平后呈卵形或菱狀卵形，灰綠色。葉對生，為羽狀三出復葉，葉端漸尖，葉緣具均勻鋸齒狀，葉基漸狹，頂生小葉較大，葉基延展近翅狀。葉柄較長，葉柄及葉面均具明顯柔毛。質輕脆。氣微特異，味微苦。

2.4.2 顯微橫切鑒定 采用石蠟切片制法制片，從顯微橫切面特征上觀察莖葉特征。

莖呈類方形。表皮細胞1列，長方形，沿切向延長，有時可見少數非腺毛。皮層窄，由5～6列細胞組成，角隅處有乳汁管，四個角中每個角隅處有三個，四邊中每個維管束上方有一個。維管束大小不等為外韌型，多個環列。韌皮部外側分布有中柱鞘纖維，多半月形，斷續呈環狀排列。木質部導管大小不等，多被木質部纖維分隔斷續徑向排列。髓部發達，約為莖橫切面的2/3以上，薄壁細胞向內逐漸增大，排列較疏松，如圖2-3。

圖2 巴西鬼針草PIC?O樣品莖的顯微橫切面

圖3 巴西鬼針草PIC?O樣品的莖(部分)橫切面

葉上表皮細胞1列，長方形，較大。下表皮細胞較小，類方形，氣孔類型為不定式。表皮細胞上有非腺毛分布。柵欄組織由1列短圓柱形細胞組成，海綿組織較發達，細胞形狀類圓形或不規則形。葉肉組織中含有分泌道。主脈處維管束3個，外韌型，木質部導管2～4個徑向排列成行。韌皮部呈半月形，如圖4。

圖4 巴西鬼針草PIC?O樣品的主脈橫切面圖

2.4.3 顯微粉末鑒定 粉末綠灰色或灰棕色。(1)非腺毛呈錐形，由多個細胞組成，頂端銳尖或漸尖。(2)導管多為具緣紋孔導管和螺紋導管，少見環紋和梯紋導管。(3)木纖維 多成束，細胞為長梭形，末端尖，多破碎，胞腔較窄，內可見紋孔。(4)葉表皮細胞不規則形，大小不等，葉下表皮氣孔為不定式。(5)花粉粒 球形，外壁具細刺狀突起。(6)莖表皮細胞排列整齊，近長方形。(7)髓薄壁細胞為大型細胞，近長方形，壁較厚。(8)韌皮纖維呈梭形，常成群存在，胞腔呈線狀。(9)棕色塊略透明，具光澤，如圖5。

3 討論

3.1 鬼針草的鑒定

研究人員對鬼針草鑒別做了大量研究。夏至等［4］通過分子鑒定方法對中國鬼針草7個近緣種進行分析，結果表明，鬼針草能與其他近緣物種鑒別開，表明了DNA條形碼對鬼針草藥材的鑒別能力。劉圓等［5］通過原植物、性狀、顯微和薄層鑒別的方法對民族藥鬼針草進行生藥學鑒定研究，表明生藥學特征能夠作為鬼針草的鑒別依據。本研究通過DNA條形碼-產地-形態分析聯用的方法鑒定巴西鬼針草來源于菊科植物鬼針草的地上部分。生藥學研究為巴西鬼針草的品種鑒別和質量控制提供依據。

圖5 巴西鬼針草PIC?O樣品的粉末圖

3.2 中巴用藥經驗交流的意義

通過比較中國和巴西鬼針草藥材的用藥經驗，為中藥擴大藥用資源和新藥開發提供依據，中國可以從巴西進口資源緊缺的品種;巴西植物藥研究處于初級階段，本研究為促進巴西草藥的臨床應用和化學、藥理研究提供品種鑒定基礎，巴西可以借鑒中國中藥的研究基礎和研究方法提高巴西草藥的現代化水平;本研究為挖掘中國和巴西草藥新資源提供參考，為中巴的傳統醫學交流奠定基礎。

［1］ 張延昌，張永明.鬼針草的研究現狀與應用前景［J］.山東教育學院學報，2004，19(4):79-83.

［2］ 吳婷妮，余長柱，李榮，等.鬼針草的研究進展［J］.安徽醫藥，2014，(9):1614-1616.

［3］ 顧選，張曉芹，宋曉娜，等.基于DNA條形碼-產地-形態聯用的藥材溯源新方法研究——以黑果枸杞1種偽品為例［J］.中國中藥雜志，2014，39(24):4759-4762.

［4］ 夏至，高致明，李賀敏，等.鬼針草及其近緣種的分子鑒定和親緣關系研究［J］.中草藥，2014，45(6):828-834.

［5］ 劉圓，王杰，彭鐮心，等.民族藥鬼針草的生藥學鑒定［J］.西南民族大學學報(自然科學版)，2006，32(3):568-571.

［6］ 胡偉，陳飛虎，吳繁榮，等.鬼針草藥材的生藥學鑒定［J］.時珍國醫國藥，2009，20(2):329-330.