用高效液相色譜儀測定葡萄休眠芽的脫落酸含量

摘要：以6年生“赤霞珠”葡萄的休眠芽為材料，應用高效液相色譜法測定葡萄休眠芽中的脫落酸(ABA)含量。葡萄休眠芽中的脫落酸用80％冷甲醇抽提，抽提液在石油醚和水相之間分配，后經過吡咯烷酮(PVP)凈化和乙酸乙酯萃取，最后用甲醇、水作為流動相，在ODS－C₁₈柱上進行分離，用紫外檢測器在260nm波長下檢測、鑒定。結果表明，高效液相色譜法檢測赤霞珠葡萄休眠芽中內脫落酸，含量為2.177pμg·g_1-。

關鍵詞：脫落酸(ABA)；高效液相色譜法(HPLC)；葡萄；休眠芽

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A 文章編號：1002－2910(2007)03－O004－03

檢測植物的內源激素主要有生物鑒定法，氣相色譜法(GC)，酶聯免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLＣ)。相對而言，高效液相色譜法靈敏度高、專一性強和重復性好，是理想的分析方法，目前應用較廣泛。

葡萄冬芽的休眠與生長抑制物有關，堀居內昭發現，這種抑制物質是脫落酸(ABA)。于是筆者通過測定葡萄休眠芽內的脫落酸含量，研究休眠與內源激素的關系。

1 材料與方法

2004年12月30日于南陽市園林局植物園選取健壯成熟的“赤霞珠”葡萄(6年樹齡)的休眠芽為試材，用島津LC－10AT高效液相色譜儀檢測。色譜條件為色譜柱ODS－C₁₈柱；流動相中甲醇與水(1％醋酸)的比例為35：65(V/V)；檢測波長在260nm處；柱溫45℃；流速每分鐘0.9ml；進樣20tμL。

準確稱取脫落酸的標準樣品1.00mg于25ml容量瓶中，用甲醇(色譜純)定容至25ml，配成0.4g／L的脫落酸標準母液。使用時再用甲醇配成不同濃度的脫落酸標準液。

葡萄休眠芽內脫落酸的提取工藝流程為：準確稱取葡萄冬芽3.00g，研碎后加入80％甲醇40ml。抽濾時在漏斗中墊4層濾紙，以充分除去樣品中的懸浮顆粒；乙酸乙酯萃取為等體積萃取；吡咯烷酮(PVP)的用量為0.6g，攪拌10分鐘后抽濾。具體流程如下：

2 結果與分析

2.1 分析條件選擇

吸收波長的選擇。取脫落酸的標準溶液在紫外分光光度計上光譜掃描，在波長240－270nm處脫落酸有較高吸收峰。結合高效液相色譜分離條件下脫落酸與雜質峰的分離情況，選擇在260nm處測定葡萄休眠芽脫落酸含量。

選擇反相液相色譜法通常使用的流動相(甲醇：水)，并加入一定量的乙酸，使脫落酸以分子形態存在，這樣檢出的峰形好且不拖尾。經大量試驗證明：對葡萄休眠芽的提取液來說，當甲醇與水的比例為35：65(V/V)時，脫落酸與鄰近的雜質峰分離效果較好。

流動相的pH值為3.0時脫落酸處于分子狀態，此時檢出的峰形較好，不拖尾，同時考慮到ODS－C₁₈柱的耐酸性和使用壽命，在流動相中加入1％的醋酸，使pH值為3.0。

分別在流速為每分鐘0.85ml、0.90ml和1.00ml下進行分析。試驗證明：流速為每分鐘0.9ml條件下，脫落酸的峰形較好，分離度較高。發現柱溫在45％時，檢出峰分離好，因此選取柱溫為45℃。

2.2 脫落酸的分離與測定

在上述液相色譜檢測條件下，對脫落酸的標準液進行測定和分析，得出保留時間為3.479分鐘，如圖1所示。對葡萄休眠芽提取物中的脫落酸進行測定，相應的保留時間為3.432分鐘，如圖2所示。

分別以脫落酸的標準溶液25μg/L、30μg/L、35μg/L、40μg/L、45μg/L、50μg/L、55μg/L和60μg/L進樣，計算峰面積(Y)和濃度(x)的一元線性回歸方程。所得回歸方程式為Y=48.83X+32.94，相關系數R=0.995。

2.3 回收試驗

于0.5ml的樣品提取液中，加入不同濃度的脫落酸標準溶液，用與樣品相同的色譜條件進行回收試驗，重復4次，結果平均回收率為92.48％，達到了內源激素分析測定所要求的回收率。

2.4 葡萄休眠芽的脫落酸含量

根據色譜圖(圖2)所對應的峰面積和回歸方程，計算得知葡萄休眠芽的脫落酸含量為2.177μg·g^-1(鮮重)。

3 小結與討論

以甲醇為提取劑提取葡萄休眠芽中的脫落酸，通過石油醚凈化，吡咯烷酮純化，乙酸乙酯富集，用高效液相色譜分析，在以甲醇：水(35：65，V/V)為流動相，流速為每分鐘0.9ml，檢測波長為260nm的條件下，測定葡萄休眠芽中的脫落酸，方法簡便、準確、快速，符合植物激素分析的要求。

本試驗用80％甲醇提取脫落酸，用石油醚和乙酸乙酯做萃取溶劑。乙酸乙酯與甲醇互溶，而不溶于水，因此80％的甲醇提取液需要經過減壓濃縮至接近水相后，再與乙酸乙酯進行萃取。脫落酸易溶于堿性溶液和甲醇而難溶于水，因而在對提取液進行減壓濃縮時需要保留部分的甲醇溶液。當將提取液減壓濃縮至原體積的1/3，并與乙酸乙酯萃取后，得到相對較好的分層效果。在萃取過程中若有輕微的乳化現象，可加入飽和的氯化鈉溶液來破除乳化。在試驗中，分別利用石油醚和吡咯烷酮去除葡萄休眠芽提取液中的各種色素和酚類物質。在堿性條件下，利用乙酸乙酯去除酯溶性雜質，再用乙酸乙酯富集，最后甲醇溶解并定容而得到樣品溶液。樣品前處理及用高效液相色譜儀分析測定時要特別注意提取劑和流動相的pH值。脫落酸在pH值8.0的條件下，是以離子狀態存在；在pH值3.0的條件下是以分子狀態存在。因此在試驗中，用吡咯烷酮時，調節pH值至堿性，以減少脫落酸被吡咯烷酮吸附的量。而在利用乙酸乙酯進行萃取時，則調節pH值為8.0，使脫落酸易溶于堿水溶液中，取堿水相。再調節pH值為3，0使脫落酸處于分子狀態，以減少脫落酸在水相中的分配，最后取乙酸乙酯相，從而提高了回收率。用高效液相色譜儀分析樣品時，在流動相中加入1％的醋酸，使脫落酸以分子狀態存在，此時檢出的峰形較好。