聯合培養的成纖維細胞對平滑肌細胞增殖和形態的影響

[摘要]目的：觀察體外聯合培養的成纖維細胞對平滑肌細胞形態和增殖的影響，為研究成纖維細胞和平滑肌細胞生物學特性和相互關系以及體外構建含此兩種細胞的組織工程皮膚提供理論和實踐基礎。 方法：在體外分別分離培養成纖維細胞和平滑肌細胞并常規傳代培養。模擬組織工程皮膚的結構及成纖維細胞和平滑肌細胞間的相互影響途徑，按照不同比例（平滑肌細胞:成纖維細胞=1:1，1:2，1:3）建立以膠原凝膠為基質的成纖維細胞與平滑肌細胞聯合培養模型。應用熒光標記、組織學觀察和MTT法對平滑肌細胞的形態和代謝進行研究。 結果：聯合培養模型法可以有效地建立起成纖維細胞和平滑肌細胞的相互影響模式。1:1組的成纖維細胞對聯合培養的平滑肌細胞增殖有促進作用，1:3組的促增殖作用則不明顯。 結論：1:1聯合培養的成纖維細胞對平滑肌細胞增殖有促進作用，對它們體外培養和擴增以及相互關系的研究對闡明這兩種細胞組合作為真皮替代物種子細胞具有重要的意義。

[關鍵詞]成纖維細胞；平滑肌細胞；聯合培養；組織工程；膠原

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）11-1535-03

Effect of fibroblasts in co-culture model on smooth muscle cell proliferation and morphology

FENG Ya-qin 1，2，3，HUANG Sha2，YU Chun-yan1，WANG Hai-lun1，2，FENG Feng1，2，ZOU Yun-dong2，NIU Jie3，JIN Yan2

(1.Department of Dermatology，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710038，Shaanxi，China； 2.Center for Tissue Engineering，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China； 3.Weinan Convalescent Hospital of Shaanxi Military Area Command of PLA，Weinan 714000，Shaanxi，China)

Abstract： ObjectiveTo observe the effects of fibroblasts (Fb) in vitro co-culture on morphology and proliferation of smooth muscle cells (SMC)， and bio-characteristics as well as interrelation between them. To provide theoretical and practical foundation for constructing tissue engineering skin contained Fb and SMC.MethodsFb and SMC were cu1tured in vitro by dissociation and explanation of tissue individually，then implanted according different ratios（SMC : Fb=1:1，1:2，1:3）in collagen to establish co-culture model， mimicking the structure of tissue engineering skin and interaction between Fb and SMC. Morphology and metabolism of SMC was evaluated in terms of fluorescence-labeling， histological observation and MTT. ResultsCo-culture model is an effective method to establish the interaction between Fb and SMC; Fb exhibits the proliferating effects on SMC in 1:1 model of co-culture， while the effects weaken in 1:3 model. ConclusionFb plays the positive role in co-culture model (1:1) on morphology and proliferation of SMC， and the study on interaction between Fb and SMC is very important for constructing tissue engineering skin contained Fb and SMC.

Key words: fibroblasts; smooth muscle cells; co-culture; tissue engineering; collagen

真皮為皮膚提供機械保護和必要的營養并決定它的外觀特征，因此真皮替代物的研制是皮膚組織工程研究中的重點所在。近年來，用成纖維細胞與膠原等細胞外基質成分混合進行的三維培養，已成為制備組織工程皮膚的真皮替代物的主要方法[1]。在這樣的三維培養中，成纖維細胞可產生膠原蛋白等細胞外基質成分形成真皮替代物，再和表皮細胞聯合培養后形成組織工程皮膚，植入機體后經過數月甚至更長時間后才逐漸產生彈性纖維，因此，植入的組織工程皮膚在很長時間內會缺乏彈性[2]。本研究試圖在模擬組織工程皮膚結構的基礎上，利用平滑肌細胞更利于彈性纖維產生的優勢，按照不同比例建立以膠原凝膠為基質的成纖維細胞與平滑肌細胞的聯合培養模型，研究成纖維細胞和平滑肌細胞間的相互關系和生物學行為，為這兩種細胞的組合作為真皮替代物種子細胞的可行性提供實驗依據。

1材料和方法

1.1 主要試劑：磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，胰蛋白酶，乙二胺四乙酸鈉(EDTA)，胎牛血清(FBS)，M199培養基，DMEM培養基，谷氨酰胺，成纖維細胞生長因子(bFGF)等均為美國Gibco公司產品；膠原為Sigma公司生產；二甲基亞砜(MSOF)，四甲基噻唑二苯基四溴鹽 (MTT)，四季青公司生產；CX40普通光學顯微鏡和CK40倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 平滑肌細胞的原代培養和體外擴增：取健康雄性小鼠(第四軍醫大學動物實驗中心提供)，在無菌條件下迅速開胸取出心肺，分離肺動脈，將中膜剪成0.1～0.3mm2大小組織塊，貼壁于培養瓶中置于37℃恒溫培養箱內培養。當細胞密度接近融合時，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA消化傳代，取第5代或6代的細胞用于以下實驗。

1.3成纖維細胞的原代培養和體外擴增：取小鼠剩余皮片，盡可能徹底地修除表皮和皮下脂肪，將真皮剪成0.5～1.0mm2的組織塊，接種于培養瓶內，消化下來的細胞置37℃恒溫培養箱中培養4h后，再加入含150ml／L胎牛血清的DMEM培養液繼續培養，每3天換液1次。原代培養細胞基本長滿瓶壁后，進行傳代培養。取第5代或6代的細胞用于以下實驗。

1.4 細胞形態學觀察：取第5代細胞在相差顯微鏡下觀察細胞形態、生長狀態及貼壁時間，并攝片記錄。

1.5 MTT法測定細胞活性：取第5代平滑肌細胞和成纖維細胞分別以1:1、1:2、1:3（細胞數量為4000／孔）的比例接種于96孔培養板中，每孔加入200μl培養液于37℃，體積分數為0.05的CO2條件下培養。每天同一時間點隨機抽取5孔細胞，加入5％MTT 20μl/孔，培養4～6h，吸出液體，每孔加150μl二甲基亞砜振蕩10min，酶聯免疫測定儀測定波長490nm處的吸光度。取5孔吸光度的均值，以時間(天)為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪圖。

1.6 以膠原凝膠為基質的聯合培養模型的構建：①1:1組：取生長狀態良好的平滑肌細胞用Hoechst 33342標記，將其與真皮成纖維細胞按1:1比例各以1.5×106／ml的密度與3mlI型膠原(膠原濃度8mg／ml，混合前加入10%的10×DMEM 和胎牛血清，充分混勻，調節pH到7.4)混合，37℃孵育凝固后加入培養液培養5天獲得組織工程真皮即平滑肌細胞與成纖維細胞的聯合培養模型；用HE染色和熒光顯微鏡觀察構建的模型中平滑肌細胞的形態和分布；②1:2組和1:3組以不同數量的成纖維細胞代替，其余處理及檢測同1:1組。

2結果

2.1 細胞形態觀察：光鏡下觀察，第5代培養的平滑肌細胞呈細長梭形(圖1)，成纖維細胞呈細長形、扁平星狀結構(圖2)，均處于功能活躍狀態。

2.2 MTT法測定細胞代謝活性：MTT檢測結果顯示（圖3），平滑肌細胞和成纖維細胞在1:1的比例時，平滑肌細胞的增殖較快，代謝較為活躍（P＜0.05）；在成纖維細胞比例增加時（SMC : Fb=1:2、1:3），平滑肌細胞的活性一般，增殖作用不明顯（P＞0.05）。

2.3共培養模型的大體觀察：大體觀察含兩種細胞的共培養模型（圖4），所見結果與常規培養的組織工程真皮在色澤、質地等方面未見明顯差別[3]，然而由于所用平滑肌細胞和成纖維細胞比例不同，含較高比例的平滑肌細胞的皮膚模型（1:1）的外觀明顯好于含平滑肌細胞比例較低 (1:2、1:3) 的皮膚模型，尤其是1:3組模型的邊緣收縮較為明顯。

2.4共培養模型的組織學觀察：HE染色結果顯示，1:1組的細胞明顯較其它組多，細胞密度較大。梭形細胞體積較大，核大、淡染，核仁明顯，表明此時細胞的合成功能很活躍。而1:3組的細胞體積較小，核深染、核仁不明顯，胞質少，各組合成的共培養模型都具有真皮替代物的結構(圖5)。

本實驗采用Hoechst 33342標記平滑肌細胞的方法對共培養模型中成纖維細胞對平滑肌細胞的影響進行了分析。熒光顯微鏡下各組模型所形成的真皮層均能觀察到標記為藍色熒光的平滑肌細胞分布（圖6）。

3討論

隨著細胞培養技術的發展和組織工程學的興起，皮膚組織的體外重建正由設想變為現實。近年來，國內外已有不少學者將體外培養的皮膚替代物移植應用于臨床修復創傷皮膚缺損創面[4-5]。由成纖維細胞作為種子細胞構建的真皮替代物具有較強的生物活性，不引起免疫排斥反應，而且可促進表皮細胞生長及表皮真皮連接形成，改善移植物的物理性能和美觀效果。然而這樣構建的真皮替代物植入機體后，往往需要在數月至2年后才逐漸產生彈性纖維。已有文獻證實平滑肌細胞與膠原等多糖基質混合培養后可產生彈性纖維[6]。因此，我們考慮將平滑肌細胞也作為種子細胞引入真皮替代物的構建，進一步改善皮膚替代物的功能性。在本實驗中，筆者將重點放在觀察體外聯合培養的成纖維細胞對平滑肌細胞形態和增殖的影響上，以此證實這兩種細胞的相互關系和共同作為種子細胞體外構建組織工程皮膚的可行性和潛能。

實驗結果顯示，以膠原凝膠為基質建立的聯合培養模型法，可有效評估成纖維細胞對平滑肌細胞的影響。1:1組的成纖維細胞對聯合培養的平滑肌細胞有明顯促增殖作用，1:3組的成纖維細胞比例過高，促增殖作用反而不明顯。顯微鏡觀察可見，平滑肌細胞在1:1聯合培養組所構建的真皮替代物中分布均勻，細胞體積與胞核均較大，提示該細胞的合成功能活躍，這可能與成纖維細胞分泌的各種生長因子的作用有關。但成纖維細胞比例的增加，對平滑肌細胞的增殖作用反而會減弱，因此探討合適的培養比例對它們聯合培養和擴增以及相互關系的研究具有重要的意義。綜上所述，通過觀察聯合培養的成纖維細胞對平滑肌細胞增殖和形態的影響，筆者認為用1:1聯合培養的成纖維細胞對平滑肌細胞增殖有促進作用，這兩種細胞的組合有望共同作為種子細胞構建一種新的真皮替代物。

[參考文獻]

[1]楊穎藕， 于淑賢， 賈繼章， 等．利用膠原構建皮膚組織工程支架的研究 [J]. 中國修復重建外科雜志，2003，17(4)：339-342.

[2]Shakes P. Bum wound healing and skin substitutes[J]. Burns， 2001， 27 (4)：517-522.

[3]胡葵葵， 戴育成， 袁敬東. 組織工程活性真皮的構建研究[J]. 西安交通大學學報：醫學版，2006，27（2）：117-119.

[4]Heimbach DM， Warden GD， Luterman A， et a1. Multicenter postapproval clinical trial of Integra(r)dermal regeneration template for burn treatment[J]．J Burn Care Rehabil，2003，24(1)：42-48.

[5]Hu M， Sabelman EE， CaoY， et a1. Three-dimensional hyalurc acid grafts promote healing and reduce scar formation in skin incision wounds[J]. J Biomed Mater Res， 2003，15: 586-592.

[6]Yu LX， Zou ZH. Aortic smooth muscle cells produced elastic fibers in three-dimentional culture [J]. Acta Anatomica Sinica， 2004， 35(1): 74-78.

[收稿日期]2007-06-21[修回日期]2007-10-21

編輯/張惠娟