軟骨蛋白聚糖研究進展

王正輝 綜述 楊壯群 賀西京 審校

軟骨組織存在于機體的許多部位，透明軟骨是軟骨的主要形式，普遍存在于骨骼系統中，如胚胎時期的骨生成始基、幼年個體發育期引導骨增長的生長板以及關節的骨軟骨負重面等。所有的透明軟骨都含有大量的特征性物質蛋白聚糖（proteoglycan，PG），它主要以透明質酸和連接蛋白合成的蛋白聚糖聚合物形式存在，在軟骨中通過其滲透性使軟骨膨脹以抵抗軟骨所受的壓縮力。自20世紀80年代中期以來，蛋白聚糖在軟骨損傷中的降解機制就一直為研究的熱點[1]。

1蛋白聚糖的結構與功能

1.1 蛋白聚糖聚合物：蛋白聚糖聚合物(aggrecan)是一種有多個功能域的模板蛋白聚糖，其核心蛋白有三個球形區域，由G1、G2、G3組成，每個域都含有半胱氨酸殘基并以氫鍵連接，G1和G2由球間域分隔，G2和G3間有糖胺聚糖(GAG)附著區，其中富含硫酸軟骨素(CS)和硫酸角質素(KS)。G1位于核心蛋白的氨基端，可分為三個功能域A、B1、B2，B型域和透明質酸（HA）有交互作用；G2也有兩種B型域，但與HA無相互作用，目前其功能尚不明確；G3位于核心蛋白的羧基端，含有多種特殊結構域，它對于蛋白聚糖核心蛋白正常的翻譯后加工及后續的蛋白聚糖分泌作用是不可少的。GAG附著區由三個可附著CS和KS的域組成。

蛋白聚糖分子并非孤立地存在于細胞外基質中，而是以aggrecan形式存在［2］。每個aggrecan都由位于中心的透明質酸鏈和其發出的100個蛋白聚糖分子組成，相互之間以連接蛋白連接加以穩固。巨大的aggrecan分子在組織中被膠原支架包裹從而使蛋白聚糖穩定于胞外基質中［2］。軟骨中aggrecan很少以完整的形式存在，取而代之的是受細胞外蛋白酶解加工的核心蛋白，最終產生的aggrecan不是完整的蛋白聚糖分子［3］。參與aggrecan代謝的生物大分子很多，降解代謝最重要的兩種酶是基質金屬蛋白酶(MMPs)和多聚蛋白聚糖酶(aggrecanaes)[4]，而合成代謝中最重要的是組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)[5]和α2巨球蛋白[6]。這四種生物大分子之間的相互作用和制約維持著PG的代謝平衡。

蛋白聚糖基因突變導致的軟骨發育不全在人類已有報道，在人的外顯子12處插入單個堿基對會引起移碼，造成一種脊柱骨骺發育不良[7]。這些病癥表明蛋白聚糖的含量對胚胎軟骨的發育和生長起重要作用。

1.2 連接蛋白：連接蛋白(link protein，LP)結構類似于蛋白聚糖的G1區域，具有A、B1和B2域，是蛋白聚糖家族成員。其中A1和G1相互作用，B2 則與HA相互作用[10]。完整的人類軟骨連接蛋白以兩種分子形式存在（LP1、LP2），區別在于其氨基末端分別有2個或1個N-連接寡糖鏈。

哺乳動物有4個連接蛋白基因，其中有一個主要在軟骨內表達，每個LP基因都與一個透明質酸基因相鄰，但它并不與臨近的必需基因共表達，因為軟骨的LP基因和蛋白聚糖基因不相毗鄰。軟骨的LP在aggrecan中有多種功能：①與蛋白聚糖的HA和G1域相互作用來維持蛋白聚糖的穩定性，預防蛋白聚糖的降解；②參與一種“遲緩聚合”現象，因新近分泌的蛋白聚糖不和HA發生作用，而是通過其G1區的由LP介導的一種構象變化來促進聚集體的形成；③LP和G1域共同形成一種蛋白質外殼，覆蓋于HA表面保護HA免受透明質酸酶和自由基作用而發生降解。

1.3 HA：HA是一種以較大的長度及獨特的合成模式為特征的未硫酸化的GAG，通過透明質酸合酶(HAS)而分布于細胞膜上[8]，哺乳動物有三種HAS（HAS1、HAS2、HAS3），各自位于染色體的不同部位。HA由于它獨特的合成物模式而被擠出細胞核，作為外殼分布于軟骨細胞周邊，而蛋白聚糖最初可能也位于此處，至于蛋白聚糖聚合物是如何從此處被釋放并移至胞外基質目前尚不清楚。軟骨中HA隨著年齡的增長其體積逐漸減小而含量逐漸增多[8]。

HAS1、HAS2、HAS3都在軟骨內表達，有研究顯示人軟骨細胞在生長因子和細胞活素的作用下呈現不同的表達規律，其中HAS2表達水平最高，HAS3表達水平最低。最近對軟骨HAS2 敲除小鼠的研究表明：軟骨HAS2基因的缺失表達會導致嚴重的骨骼異常及圍產期死亡[9]，這揭示了HA和aggrecan在維持正常軟骨功能及軟骨分化和軟骨內骨化中的重要作用，也表明了在軟骨HAS1或HAS3的表達不能夠補償HAS2的缺乏。

1.4 SLRPs：SLRPs屬于富含亮氨酸的蛋白質大家族，依據基因的組構、亮氨酸重復序列的數量及GAG鏈結構的類型而分為多個子家族 ，如核心蛋白聚糖、二聚糖、纖維調節素及具有10個亮氨酸重復序列的光蛋白聚糖。已有研究報道核心蛋白聚糖和纖維調節素在體外被MMPs 降解，而該降解在體內也可能發生[8]。纖維調節素和光蛋白聚糖作用于膠原分子的相同區域，該區域與核心蛋白聚糖的作用位點不同，核心蛋白聚糖的作用涉及亮氨酸重復序列中的氨基酸序列。GAG鏈和多種生長因子相互作用使SLERPs在細胞外基質中為生長因子提供場所。該研究還顯示SLRPs通過調節細胞中的生長因子來調節軟骨細胞的代謝[9]。SLRPs的合成水平隨年齡而變化，其含量隨年齡變化的確切機制尚不明確，但其產物的缺失能影響組織特性這一點是毋庸置疑的。核心蛋白聚糖的缺乏會導致鄰近纖維組織的融合，膠原纖維的形態不規則；二聚糖缺乏會導致類骨質疏松癥表型，動物生長率下降和骨量減少。該研究明確表明SLRPs不足會引起組織中膠原纖維結構的破壞，且每種蛋白聚糖都有其特異性的異常表型[9]。

2蛋白聚糖與骨關節病

2.1 大骨節病(KBD)：KBD主要病理改變是四肢透明軟骨的變性壞死，其蛋白聚糖代謝存在明顯異常。研究發現KBD病區水中的致病因子促使猴軟骨GAG分子低硫酸化，這種代謝異常與KBD軟骨組織的病理形態學改變密切相關。顏煒群等[10]觀察了KBD患者血清對培養軟骨細胞PG代謝的影響，實驗結果表明KBD患者血清中存在干擾PG代謝的因子，可致PG合成能力明顯下降，分解代謝增加，以致軟骨中PG含量減少，在結構上呈現出低硫酸化、低分子量和缺乏HA結合區，不能與HA結合形成aggrecan。這些研究結果提示aggrecan的分子損害是KBD的一個非常重要的特征[10]。

2.2 骨關節炎(osteoarthritis ，OA)：OA 時PG結構組成和分布發生明顯變化[11]，首先PG聚合程度明顯降低，aggrecan比例減少，其完整性遭到破壞，可分解為不同大小的片斷。GAG變化表現為KS含量減少，CS含量相對增多；結構也發生變化，硫酸化程度下降，HA進行性耗竭，預示aggrecan形成能力下降。OA時關節各部位的PG變化也不一致，最早、最典型的變化在負重區，在同一部位則最早變化于軟骨表層，正常時軟骨表層有較多量與表面平行排列的膠原，PG減少和水合增加改變了基質的離子組成使膠原松散，并且PG與膠原的交聯率也減少。膠原結構的破壞使位于其間的PG暴露，易于裂解并引起免疫反應。OA時首先發生PG降解，檢測體液的PG降解產物為早期診斷提供了依據。PG在細胞粘附、細胞間交流、信息傳遞以及細胞增殖和分化等多方面扮演了重要角色，它的降解在OA發生、發展中起到了關鍵性的作用。

3蛋白聚糖與軟骨移植

軟骨移植的組織來源主要以自體、同種異體和異種軟骨移植物為主。其中，同種異體移植軟骨為僅次于自體軟骨的良好生物材料，其成本低、來源廣泛且生物學性能良好的優點，使其目前在臨床上應用較多，效果良好，臨床成功率可達90％以上[12]。在正常情況下，蛋白聚糖的合成與分解保持動態平衡，這種平衡有利于維持軟骨基質結構與功能的完整性[13]。致病因素所導致aggrecan的丟失可以視為軟骨代謝失衡的始動環節，如持續存在，則引起關節軟骨膠原纖維的降解和各種炎性信息因子的釋放，引發瀑布效應，進而徹底打破關節軟骨的代謝平衡，使其進入不可逆性的負代謝狀態，導致細胞外基質屏障破壞，最終導致軟骨的吸收。

研究發現同種異體軟骨移植后軟骨ECM大量衰退，尤其在移植后一個月內最為明顯，表現為基質中蛋白聚糖含量發生較大的變化[14]。移植前的軟骨細胞不表達主要組織相容性抗原，移植后一個月左右開始表達，并逐漸增強[15]。最終導致軟骨吸收、降解，影響手術遠期效果。因此，研究蛋白聚糖在軟骨移植中的降解機制無疑對移

植手術的術后效果是很重要的。

4蛋白聚糖與軟骨組織工程

軟骨組織工程是應用工程學和生命科學的原理和方法， 將種子細胞與生物載體材料(即支架)復合后進行培養，在體內形成具有生理功能的軟骨組織，替代和恢復病變軟骨組織的功能。因此，種子細胞的選擇、培養和軟骨細胞支架材料的研究兩個環節在軟骨組織工程中顯得尤為重要。軟骨細胞是常用的種子細胞，隨著培養時間的延長和傳代次數的增多，軟骨細胞的特異性表型Ⅱ膠原和aggrecan逐漸減少，影響軟骨的形成[16]。因此蛋白聚糖已成為檢測軟骨組織工程的重要指標[16-17]。

5展望

軟骨蛋白聚糖作為軟骨基質的關鍵組成部分，在維持軟骨的生理功能方面發揮了重要的作用。軟骨移植后的首要變化就是蛋白聚糖的丟失，在KBD、OA等關節疾病領域對蛋白聚糖的降解已有了較為深入的研究，但尚未見用于軟骨移植研究的報道。因此借鑒骨關節疾病中關節軟骨基質蛋白聚糖代謝的研究方法，進一步探討軟骨代謝改變在軟骨移植后及軟骨組織工程的作用，將對軟骨移植機制的闡明及預防軟骨的丟失和減少排斥反應有重要的意義。因此如何維持蛋白聚糖的穩定性，從而保持細胞外基質的免疫屏障作用，減少異體軟骨的排斥反應及吸收，將是我們進一步研究的內容。

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[收稿日期]2007-08-10 [修回日期]2007-10-24

編輯/李陽利