以凍干骨為平臺重建組織工程化關節軟骨的研究

[摘要]目的：探索在兔凍干異體骨關節平臺上利用組織工程的方法再造人工關節軟骨的可行性。方法：實驗分成四組，運用組織工程方法將不同構成的同種異體兔軟骨細胞-支架材料復合物種植于兔凍干異體骨關節平臺上，植入實驗兔體內，3月后取材觀察體內成軟骨情況。結果：僅種植兔軟骨細胞的凍干骨關節支架上未見新生軟骨形成。粘合有種植兔軟骨細胞的PLGA膜片的凍干骨支架關節腔內見新生類軟骨樣物出現。自體軟骨層孔洞缺損模型使用軟骨細胞-PLGA膜片復合物可修復軟骨缺損。結論: 軟骨細胞-PLGA膜片復合物實驗動物關節內可形成軟骨樣物；但在凍干骨關節平臺上尚不能形成有功能意義的關節軟骨層。

[關鍵詞]凍干骨； 聚羥基乙酸聚乳酸共聚物； 組織工程； 軟骨

[中圖分類號]Q819[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）10-1337-03

Experimental study of the articular cartilage regeneration on the surface of the freeze-dried bone joint

WANG Yong-chun，SHEN Zun-li，SHEN Hua，QIAN Jun，ZHANG Zhao-feng，JIA Wan-xin，CAI Yan-xian

(Department of Plastic Surgery，Affiliated First People's Hospital of Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200080，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of new cartilage formation on the surface of a freeze-dried bone joint by tissue engineering approach.MethodsThe chondrocytes-scafford constructs by tissue engineering were implanted into the rabbit joint defects. Samples were harvested 3 months post implantation to detect the cartilage formation.ResultsNew cartilage-like tissue can be seen on the surface of cell-PLGA constructs， however， it can not be found on the freeze-dried bone joint with only cell seeded. The defects of articular cartilage hole-model can be repaired with cell-PGLA chaff constructs.ConclusionAlthough chondrocytes-PLGA chaff constructs can be used in cartilage tissue engineering， they can not produce functional articular cartilage on the surface of the freeze-dried bone joint.

Key words: freeze-dried bone; PLGA; tissue engineering; cartilage

骨關節軟骨面的完好對關節功能的正常發揮有重要意義。經凍干消毒處理的同種異體凍干骨移植后經爬行替代作用可逐漸被自體骨取代[1]，但同種異體凍干關節軟骨組織凍干處理后軟骨細胞已基本滅活，移植后軟骨面會破壞吸收融合，無法供患者長期使用。我科室自20世紀80年代開始應用凍干異體骨關節加拇甲瓣法再造手指280余例[2]，術后經長期隨訪攝片觀察發現異體凍干骨可通過爬行替代作用逐漸被自體骨取代；而異體凍干關節軟骨大多破壞吸收[3-5]，致使再造指關節功能大多喪失，再造手指的功能受限，故此種方法一直得不到有效的臨床推廣。筆者設想應用組織工程方法將軟骨種子細胞種植于同種異體凍干骨平臺上，植入實驗動物體內觀察能否形成關節軟骨樣結構，探討這一方法的可行性。

1材料和方法

1.1 實驗材料:3月齡日本大耳白兔40只及2周齡日本大耳白兔幼兔4只，雌雄不限（復旦大學動物實驗中心提供）。胰蛋白酶、II型膠原酶及DMEM培養基購自GIBCO公司。PLGA膜片購自Synthecon公司（連峰碩士惠贈）。兔抗II型膠原多克隆抗體和生物素標記的羊抗兔 IgG購自武漢博士德。

1.2 實驗方法

1.2.1 凍干骨關節的制備和PLGA膜片的粘合：供體兔過量麻醉處死，取兔前足趾骨關節頭48個，其中10個截除關節面軟骨層，加工制成凍干骨關節[6]后環氧乙烷消毒塑料袋密封常溫保存備用。PLGA膜用0.01%多聚賴氨酸中浸泡處理，裁剪成4mm×4mm大小膜片，取完整凍干骨關節及截除軟骨層凍干骨關節各8個，用生物蛋白膠粘合劑將PLGA膜片粘合在關節面端表面，環氧乙烷消毒塑料袋密封常溫保存備用。

1.2.2 種子軟骨細胞獲取、擴增及軟骨細胞-材料復合物的體外構建：采用林荔軍[7]法獲取種子軟骨細胞，進行細胞培養。細胞貼滿皿底后傳代擴增。重復該過程至第三代細胞融合。將第三代軟骨細胞消化、計數、臺盼藍染色檢測擴增的關節軟骨細胞活力95%以上，制成細胞濃度為5×107/ml的懸液備用。將經環氧乙烷消毒后的四組材料(見表1) 分別置入四個培養皿中，用少量培養液濕化，用上述細胞懸液各5ml均勻滴在每個材料上，6h后加入培養液，以后每2天換液一次，培養至1周。

1.2.3 軟骨細胞-支架材料復合物動物體內植入及觀察：成年日本大耳白兔32只，隨機分為A、B、C、D共4組，每組8只，分別植入相對應組別的軟骨細胞-支架材料復合物。植入物種植于取左后足第2趾跖骨頭位置。A、B、C組實驗兔自跖骨頭下5mm水平咬骨鉗咬除跖骨關節頭，造成缺損長度在0.8cm左右，將相對應的A、B、C組軟骨細胞-支架材料復合物按原解剖位置植入關節缺損處，39號醫用鋼絲骨斷端處環扎內固定，關節復位，修復肌腱，關閉切口，酒精紗布包裹。D組實驗兔保留自體跖趾關節，跖骨關節頭軟骨全層用電鉆毀損，形成孔洞模型，直徑4mm，深度5mm，將軟骨細胞-PLGA材料復合物置入孔洞內，關節復位，修復肌腱，關閉切口，酒精紗布包裹。術后四組實驗兔均予青霉素80萬單位肌注，1天2次，共3天。實驗兔單只籠內放養，傷口均愈合良好，于3月后處死動物取材觀察及檢測。

2結果

2.1 大體觀察：A組表面未見明顯新生軟骨樣結構。B組和C組關節腔內可見新生物出現，呈較典型的半透明類軟骨樣結構形成；關節腔內的新生物與凍干骨平臺無緊密粘連（圖1）。D組所有樣本關節面表面均基本修復完整，原孔洞處出現白色新生物，新生物外觀光滑，探針觸感質地似軟骨樣，與周邊組織無明顯肉眼邊界（圖2）。

2.2 顯微鏡下觀察：HE染色可見A、B組凍干異體骨關節面表面軟骨組織吸收、裂解，局部破碎，軟骨陷窩處未見軟骨細胞存活，關節面處無新生軟骨層。B、C組關節腔內獲得的類軟骨樣結構鏡下可見典型軟骨光鏡下結構特點，軟骨陷窩內見活性細胞結構，細胞周邊為均勻的軟骨基質成分，軟骨樣結構邊緣可見纖維結締組織成分（圖3）。D組鏡下可見新生軟骨樣結構修復原自體關節面軟骨層孔洞缺損，新生軟骨樣組織與原自體關節孔洞缺損邊緣有較明顯組織學外觀差異，細胞形態較幼稚，但兩者粘合緊密（圖4）。II型膠原免疫組化染色均觀察到B、C組及D組HE染色顯微鏡下觀察到的軟骨結構II型膠原棕褐色反應，為陽性染色結果，證實新生物中存在特異性軟骨基質成分。

3討論

支架材料是構建組織工程軟骨的物質基礎。軟骨種子細胞的培養與擴增對微環境有特殊的要求。支架材料要能為種子細胞提供一個三維生長環境，使種子細胞在其中繁殖、生長、代謝，發揮細胞間的信號調控作用，不斷分泌細胞外基質，以逐步取代降解的支架材料，最終形成有活性的軟骨組織。

關節軟骨為透明軟骨，組織學特點為軟骨陷窩周邊為大量軟骨基質成分，形成較均勻緊密的結構，故即使經深低溫冷凍干燥處理，凍干骨關節的關節軟骨面組織仍然無法形成組織工程細胞培養所需的三維腔隙結構，總體孔隙率不足以提供細胞生長、增殖、物質交換所需的三維空間需求。故在單純凍干骨表面種植軟骨細胞進行動物體內實驗，筆者認為形成新生組織工程化關節軟骨難度大。PLGA[8-9]材料由PGA和PLA共聚而成，具有優良的生物相容性，無毒、可生物降解，可控性良好。本實驗選用的PLGA降解周期為6～8周。已有很多學者報道應用PLGA支架材料在體外或實驗動物體內再造形成各種組織工程化軟骨[10]。前期試驗中，筆者觀察到凍干骨和聚羥基乙酸聚乳酸共聚物(PLGA)材料表面軟骨細胞均有粘附增殖及基質分泌，但后者明顯優于前者[11]。因此，筆者考慮在凍干骨支架上粘合PLGA材料使軟骨細胞獲得良好的生存環境，以利再造形成類關節軟骨樣結構。

A組沒有產生新生軟骨樣組織。B組和C組關節腔內產生了經切片檢查證實的類關節軟骨樣組織。D組植入自體關節孔洞缺損3月后，取材觀察見所有樣本缺損處均基本修復，新生組織具有軟骨樣外觀及質地。顯微鏡下見較典型的單一的軟骨組織。和A組相比較，這表明軟骨細胞-PLGA膜片在類關節軟骨樣組織的形成過程中起了決定性的作用。筆者分析，在凍干骨關節面表面由于沒有出現三維立體空間結構，無法滿足軟骨細胞的營養代謝和物質交換需求，故植入實驗兔體內后軟骨細胞無法長期存活，難以重建軟骨層；與此相對應，PLGA膜片為種植的軟骨細胞提供了需要的三維立體空間結構，故在體內產生了類關節軟骨樣組織。但是，筆者在顯微鏡下同時也觀察到B、C組關節腔內出現的并不是典型的關節軟骨層結構，其與纖維結締組織共同出現，故筆者只是稱之為類關節軟骨樣組織；況且，這種類關節軟骨樣組織與凍干骨表面沒有產生緊密的組織學聯系，所以它們可能不具備關節軟骨層的組織學功能。

本實驗中異體軟骨細胞-PLGA支架材料復合物可修復D組的自體軟骨缺損，但在凍干骨支架上未能形成筆者預期的有組織學功能的新生關節軟骨層。A、B、C組植入術后形成的關節均為半自體、半異體所組成的復合關節，其營養供給必然受限；而D組的營養供給則要明顯充裕，有利于細胞的功能發揮和軟骨重建，故實驗結果理想。筆者認為凍干骨的致密的組織形成的單層界面導致種植的軟骨細胞無充足營養供給也是其可能原因。

對此，筆者設想對凍干骨材料進行一些改進或許能實現之前的實驗目的。雖然關節頭處軟骨層結構致密，但軟骨層下方即為具有三維多孔疏松網狀結構的松質骨；之前筆者制備去關節軟骨面凍干骨（C組）時在關節頸水平截骨，軟骨層下方的松質骨也同時丟棄，骨斷面為致密皮質骨，軟骨細胞或細胞支架材料復合物粘附生長不佳。筆者制備凍干骨支架時僅將致密軟骨層磨去而將軟骨層下方的松質骨保存，或可脫鈣處理去除骨內沉積的鈣鹽使支架材料結構更為疏松，脫鈣骨基質中含有骨形態發生蛋白具有促進軟骨細胞增殖、調節其分化和胞外基質合成的能力。以此為細胞載體，可能這樣的凍干骨支架有助于形成有功能意義的關節軟骨層[12-13]。這些設想需留待今后的實驗進一步驗證。

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[收稿日期]2007-06-18[修回日期]2007-09-25

編輯/張惠娟