核酸疫苗

摘 要 核酸疫苗自出現以來，就以高效、持久、廣譜、簡便、廉價、無致病性等特點，作為一種新型的疫苗而得到廣泛的研究和應用。核酸疫苗不僅有預防疾病的作用，同時還具有治療疾病的作用。在不久的將來，核酸疫苗有望成為人類防治疾病的重要手段。

關鍵詞 核酸疫苗 抗原基因 免疫機制

中圖分類號 Q-3文獻標識碼 E

20世紀90年代初，一系列關于注射外源基因在體內誘導免疫應答的報道揭開了核酸疫苗研究的序幕。由于核酸疫苗可以誘導機體產生全面的免疫應答，并且對不同亞型的病原體具有交叉防御作用，同時又具有安全、可靠、生產方便等優點，故被認為是繼減毒、滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗。核酸疫苗就是把外源基因克隆到真核質粒表面載體上，然后將重組的質粒DNA直接注射到動植物體內，使外源基因在活體內表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，引發免疫反應。

1 核酸疫苗的構建

核酸疫苗的構建是通過重組DNA技術，將抗原基因定向插入哺乳動物細胞表達載體，轉入宿主細胞后，篩選并獲得重組克隆的過程，可以分為以下4個過程：抗原基因和載體的制備；抗原基因和載體的連接；重組DNA導入宿主細胞；重組分子的篩選與鑒定。

1.1 抗原基因和載體的制備

抗原基因只有在正確的方向，正確地讀框插入載體中的啟動子下游才能被表達。因此，在核酸疫苗的構建過程中必須保證抗原基因的定向插入或插入載體后鑒定抗原基因的方向。其中，抗原基因的定向插入是較為直接和有效的方法。要做到抗原基因的定向插入，必須是抗原基因兩端分別帶有各不相同的限制內切酶的黏性末端。而載體兩端也需帶有能與抗原基因兩端分別互補配對的黏性末端；如抗原基因兩端的限制酶位點與載體不符，可通過克隆載體更換限制酶位點或設計需要限制酶位點的PCR引物，做PCR來達到目的。

1.2 抗原基因和載體的連接

1.2.1 全同源粒性末端連接

DNA插入片斷與載體用相同的內切酶切開，兩者的兩端具有相同的抗原基因和載體的連接黏性末端，這種連接稱為全同源黏性末端連接。

1.2.2 定向克隆

使外源DNA片段定向插入到載體分子中的克隆方案稱為定向克隆。定向克隆是用2個不同的限制性內切酶切割目的DNA分子，產生2個不同黏性末端來實現的。

1.2.3 平末端連接

有些限制性內切酶切割靶DNA的2條鏈不產生突出端（粒端）而產生平末端（平端）。平端之間的連接效率比粒端之間的連接效率變低，但因平端連接具有普適性，有時比較有用。例如，限制酶HaeⅢ產生的平端不僅能與HaeⅢ或其他限制酶產生的平端連接，而且能與補平或削平后的其他內切酶切割產生的3'-與5'-突出端連接。

1.3 重組DNA分子導入宿主細胞

在核酸疫苗構建過程中，操作的載體主要是質粒DNA。將質粒DNA或以它為載體構建的重組DNA導入細菌的過程稱為轉化。而將質粒DNA或以它為載體構建的重組DNA導入真核細胞的過程稱為轉染。

1.4 重組子的篩選與鑒定

重組子的篩選與鑒定可以在各個水平上進行，例如DNA水平、蛋白質水平及基因所能表現的功能水平。DNA水平有酶切、PCR初步鑒定、核酸雜交和DNA序列分析。蛋白質水平有插入失活雙抗生素對照篩選和插入失活、Lacz’基因的藍白斑篩選。

2 核酸疫苗的免疫

2.1 免疫的機制

質粒DNA被導入細胞后，得到抗原編碼基因。即在質粒所帶強啟動子的作用下表達抗原基因蛋白，隨后被降解成8～12個氨基酸的短肽，這些短肽含有不同的抗原表位。來源于胞液和囊液的抗原表位則分別與MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子結合，并被遞至到細胞表面，與MHC-Ⅰ類分子結合的短肽激活CD8+T細胞（CTL），與MHC-Ⅱ類結合的短肽則激活CD4+T細胞（T輔助細胞）。而分泌到細胞外的抗原則為帶有抗體的B細胞捕捉，并在T輔助細胞分泌淋巴因子的刺激下轉化為漿細胞，大量分泌抗體。

2.2 抗免疫接種的途徑

抗原的表達是決定于被細胞攝取的DNA量以及抗原基因在被轉染細胞中的表達水平和持續時間。被轉染細胞的數量取決于核酸疫苗的劑量和劑型核細胞種類。同時，由于在某一點的DNA攝取劑量與該點的注射量并非成正比，因此，在考慮免疫接種的總劑量時還應將免疫劑量分數個點連續接種以增加攝取量。

目前，核酸疫苗的免疫接種途徑有肌肉注射、基因槍介導的皮內或皮下導入、黏膜表面涂布、靜脈注射和腹腔注射。其中肌肉注射是目前應用的最廣泛且被證明是十分有效的免疫接種途徑，靜脈注射的保護效率也達83％。

3 核酸疫苗的特點

3.1 激發機體全面的免疫應答

其保守抗原的保護性免疫應答對不同亞型的病原體有交叉抵御作用，能聯合免疫，即可將編碼不同抗原的基因構建在同一個質粒中或將不同抗原基因的多種質粒聯合應用，制備多價核酸疫苗。

3.2 免疫效果好、免疫應答持久

核酸疫苗能在個體內長期存在并持續表達低水平的抗原蛋白，無須后續免疫注射而能夠誘導持續的免疫效應達一年以上。與普通蛋白疫苗不同，核酸疫苗能在自身細胞中產生外源性蛋白，這種蛋白交織在原核生物表達系統中產生的蛋白質更像天然分子，其遞生過程與自然感染十分相似。核酸疫苗表達的接近天然構象，抗原性強。因此，這樣的免疫原將含有在構象上相關的表位，誘導產生對應于天然抗原的免疫應答。另外，核酸疫苗對已有免疫力的個體接種仍可起作用。

3.3 導致細胞毒T淋巴細胞激活而誘導細胞免疫

傳統疫苗中只有活疫苗能誘導細胞免疫，但活疫苗存在著恢復感染的危險，尤其在免疫抑制或營養不良的個體中以及存在其他病毒感染的情況下。核酸疫苗與減毒活疫苗和載體活疫苗一樣引起CTL應答，但卻不存在后兩者毒力回升的危險，也不存在散毒現象。

3.4 方法簡便、價格低廉、便于儲存和運輸

核酸疫苗僅需要在細菌中生產，構建高效表達質粒，與普通疫苗相比，核酸疫苗的制作省去了抗原提取和純化等繁瑣耗時的過程，核酸疫苗用量少，干燥的DNA在室溫下相對穩定，不需要冷藏設備，比其他疫苗更經濟。

4 核酸疫苗的應用

醫學科學迅速發展的今天，核酸疫苗可以克服所選用的抗原不能在宿主細胞中表達，而可以類似于病原微生物感染方式產生抗原，這種天然構系的抗生素原能按正常途徑加工處理并提呈給免疫系統，從而激發免疫應答。目前，常用的核酸疫苗有乙型肝炎核酸疫苗、艾滋病核酸疫苗、流感病毒核酸疫苗、瘧疾核酸疫苗、利什曼病核酸疫苗、豬帶絳蟲病核酸疫苗、腫瘤核酸疫苗等。

目前，核酸疫苗不僅用于感染性病原體的防治，并且在自身免疫性疾病等與免疫相關的疾病中也能發揮出重要作用。由于核酸疫苗引發TH2性免疫應答能對自身免疫性疾病防治產生深遠的影響。研究人員做了用核酸疫苗預防實驗室自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的嘗試，并取得成功。因此，核酸疫苗在治療TH1免疫反應介導的自身免疫性病，如多發性硬化、青少年型糖尿病和類風濕性關節炎等疾病，有廣泛的應用前景。

5 核酸疫苗的潛在缺陷

5.1 核酸疫苗導入與致癌的可能性

核酸疫苗是介于生物治療劑與基因治療劑產品之間的療法。外源基因導入后，有可能激活內源性原致癌基因，或者使宿主抗癌基因失活，這一可能性不容忽視。目前檢查的1 800余種核酸疫苗中，雖然沒有發現外源基因與宿主染色體整合的證據，但核酸疫苗真正應用于人體之前，這個問題必須加以解決，如果核酸疫苗DNA與宿主染色體發生整合，可能會發生難以預料的嚴重后果。

5.2 產生抗DNA抗體

目前對于抗DNA抗體的產生原因有2種觀點：一是有B淋巴細胞增生而產生，二是抗原特異性選擇引起B淋巴細胞活化而產生。

5.3 持續表達外源抗原可能產生不良后果

從理論上講，外源抗原表達的時間越長，產生不良后果的可能性越大。可能產生的不良后果包括：產生耐受性、自動免疫、過敏反應、超免反應等。另外還有2個不容忽視的后果：一是持續低水平的表達的抗原可能會被血中的抗體清除，不能引起足夠的免疫答應；二是持續高水平的表達外來抗原，可能引起機體超免反應，最終導致機體免疫抑制而易感染其他病原體。